Plasmide
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1 ADN chromosomique (bactérien).
2 Plasmides.
Un plasmide désigne en microbiologie ou en biologie moléculaire une molécule d'ADN surnuméraire distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de la cellule. Le terme plasmide fut introduit par le biologiste moléculaire américain Joshua Lederberg en 1952[1].
Les plasmides sont généralement circulaires comme ils peuvent aussi exister en forme bicaténaire. Ils se trouvent quasi-exclusivement dans les bactéries, à l'exception notable du plasmide 2Mu que l'on trouve hébergé par un micro-organisme eucaryote (Saccharomyces cerevisiae ou levure de boulangerie).
Une cellule bactérienne peut en contenir une copie, pour les grands plasmides, ou des centaines pour des plasmides artificiels (construits par génie génétique à des fins de clonage de gènes). Les bactéries en comportent généralement 5 à 30 copies, les levures entre 50 et 100 exemplaires par cellule. Les gènes de plasmides sont non-nécessaires mais avantageux pour la bactérie.
Plusieurs plasmides différents peuvent coexister dans une même cellule sous condition de leur compatibilité mutuelle. Certains plasmides sont capables de s'intégrer aux chromosomes ; on appelle ces plasmides des épisomes.
Les plasmides participent aux transferts horizontaux de gènes entre les populations bactériennes, et donc à la dissémination des gènes conférant des avantages sélectifs (par exemple des résistances aux antibiotiques ou des facteurs de virulence). La mobilité des plasmides (par conjugaison) au sein des populations bactériennes accroît le spectre d'hôte des gènes impliqués dans la virulence. Ces gènes offrent en contrepartie un avantage sélectif pour le plasmide et les bactéries hôtes. On conçoit donc la nature quasi-ubiquitaire et persistante des plasmides chez les bactéries pathogènes.
Réplication et transmission
1 et 2. Gène(s) codant la (les) résistance(s).
3. Origine de réplication.
Chaque plasmide contient au moins une séquence d'ADN qui sert d'origine de réplication, ou ori (un point de départ de réplication de l'ADN), permettant à l'ADN plasmidique d'être dupliqué indépendamment du chromosome bactérien ou de levure, en utilisant la « machinerie » de la cellule hôte. Les plasmides peuvent être circulaires, ou parfois linéaires, présentant une ressemblance superficielle avec les chromosomes eucaryotes.
Comme les plasmides présents chez les bactéries ne portent habituellement pas de gènes essentiels à la cellule procaryote, leur pérennité dans une lignée de bactéries dépend donc de divers moyens de stabilisation des plasmides, laquelle résulte de divers processus de sélection et de conditions environnementales. De plus, les plasmides peuvent servir de synthétiseur pour les bactéries.
Les plasmides peuvent se transmettre d'une bactérie mère à une bactérie fille grâce à la conjugaison bactérienne par l'intermédiaire de pili sexuels. Lors de la division cellulaire, les plasmides se répartissent de façon totalement aléatoire (contrairement aux chromosomes) ainsi, même si la probabilité reste faible, il se peut qu'une des deux cellules filles ne possède aucun plasmide. La probabilité augmente avec la diminution du nombre de plasmides présents dans la cellule mère.
Épisomes
1. ADN chromosomique.
2. Plasmides.
3. Division cellulaire.
4. ADN chromosomique avec plasmides intégrés.
Un épisome est un plasmide qui peut s'intégrer dans l'ADN chromosomique de la cellule hôte. De ce fait, il peut rester intact pendant de longues périodes, être dupliqué à chaque division cellulaire de l'hôte, et devenir partie intégrante de son patrimoine génétique. Le terme n'est plus en usage pour les plasmides, depuis qu'il a été établi qu'une région d'homologie avec le chromosome, comme un transposon, fait d'un plasmide un épisome. Dans les systèmes mammifères, le terme épisome fait référence à un ADN circulaire (comme un génome viral) attaché au chromosome de la cellule-hôte de façon non-covalente.
Vecteurs
Existant à l'état naturel, les plasmides sont par ailleurs très utilisés dans les laboratoires comme vecteur de clonage. Cette technologie est couramment utilisée en biologie moléculaire.
Propriétés codées par les plasmides
Plasmides conjugatifs
Les plasmides conjugatifs sont les premiers plasmides qui ont été découverts chez la bactérie Escherichia coli dans les années 1950. On les appelle aussi facteurs de fertilité ou plasmides F. Ces plasmides confèrent à la bactérie hôte la capacité de synthèse de pili dit sexuels. Par l'intermédiaire de ces pili, la bactérie porteuse (donneuse) peut transférer une copie du plasmide F par processus de conjugaison bactérienne. Les plasmides F possèdent au minimum une origine de réplication et tous les gènes nécessaires à la synthèse des pili et du transfert du plasmide. Certains plasmides F sont des épisomes, c'est-à-dire qu'ils peuvent s'intégrer dans le génome chromosomique.
Plasmides de résistance
Les plasmides de résistance, appelés aussi plasmides ou facteurs R, codent des résistances aux antibiotiques et aux métaux lourds.
En 1959, au Japon, on a retrouvé chez les malades atteints de dysenterie bactérienne une insensibilité à tout traitement antibiotique. En fait, la bactérie responsable, Shigella dysenteriae, portait des gènes de résistance à plusieurs antibiotiques encore jamais rencontrés. Par la suite, on en a retrouvé chez d'autres bactéries (comme E. coli) et ces plasmides furent baptisés R Factor pour facteurs de résistance (R factors que l'on considérait comme des éléments constitués de RTF Factors ou resistance transfer factors. Ces descriptions réalisées par des équipes japonaises (et publiées en japonais) ont été synthétisées dans un article écrit par Watanabe en 1963[2] ayant fait date dans l'histoire de la microbiologie, puisqu'il ouvrit la voie à la découverte des plasmides dont la première description fut réalisée par Joshua Lederberg et coll.
Ces plasmides peuvent protéger la cellule par différents moyens que sont la modification de cible (la cible de l'action d'un antibiotique se voit modifiée, rendant la bactérie résistante à cet antibiotique), la résistance enzymatique (la bactérie produit une substance -une enzyme- capable d'inactiver directement l'antibiotique en la dénaturant, l'hydrolisant etc. (c'est le cas par exemple des bêta-lactamases), imperméabilité de l'enveloppe cellulaire (par modification des porines) et efflux actif (lié à des pompes d'efflux) -ces deux mécanismes ayant pour effet d'empêcher la pénétration intra-cellulaire de l'antibiotique ou de favoriser son extrusion active hors du micro-organisme).
Plasmides métaboliques
Les plasmides métaboliques portent des gènes permettant l'utilisation de certains nutriments. Chez E. coli, les gènes portés par ces plasmides sont par exemple : l'utilisation du citrate comme source de carbone, la production de soufre, l'hydrolyse de l'urée. Chez les salmonelles on a observé la dégradation du lactose ce qui est totalement inhabituel chez ce genre bactérien. La plupart de ces plasmides codent la synthèse d'une ou de plusieurs enzymes.
Plasmides de virulence
Il s'avère que les bactéries pathogènes hébergent très souvent des plasmides conjugatifs qui participent à la pathogénicité. Les plasmides de virulence portent des gènes codant des facteurs de virulence, ayant un rôle dans le pouvoir pathogène des bactéries. Par exemple les Escherichia coli entérotoxigéniques (ETEC) responsable de la diarrhée du voyageur (ou tourista) hébergent au moins deux plasmides, l'un portant les gènes codant un facteur de colonisation, l'autre codant des toxines.
De même, les déterminants du pouvoir invasif des Shigella sont portés par un plasmide (pInv). Chez d'autres bactéries pathogènes (par exemple Salmonella), ces plasmides codent un complexe protéique situé sur la paroi de la bactérie : c'est le complexe pili-adhésine qui permet à la bactérie d'adhérer sur des récepteurs hydrocarbonés situés à la surface de certaines cellules eucaryotes notamment les entérocytes. Certains plasmides codent des facteurs tumorigènes ; c'est notamment les cas pour la « galle du collet » due à un plasmide Ti (pour tumor inducing) hébergé par les bactéries du genre Agrobacterium.
Plasmides de bactériocines
Ces plasmides codent la synthèse d'une protéine extracellulaire dont la biosynthèse est létale pour la bactérie productrice ainsi que pour les autres bactéries non-productrices environnantes. Cependant, ces plasmides codent aussi une deuxième protéine intracellulaire de résistance à cette première toxine. Les bactériocines agissent sur des fonctions vitales de la bactérie.
Chez E. coli, on trouvera différentes catégories de bactériocines (colicines codées par les plasmides col) et par exemple le gène colE1 code une endonucléase et le gène colE3, une ribonucléase qui inactive les ribosomes.
Fabrication de plasmides recombinants
Un plasmide recombinant est un plasmide dans lequel a été inséré un fragment d'ADN étranger. Exemple: Lors du séquençage de l'ADN (voir ci-dessous),les plasmides accueillant de L'ADN génomique sont appelés plasmides recombinants.
Application en génie génétique
Application pour la production de molécule
On désire faire produire par des bactéries une certaine protéine (protéine d'intérêt). C'est par l'intermédiaire de plasmides qu'on introduira dans des cultures de bactéries un gène codant notre protéine d'intérêt et un gène de résistance à un antibiotique X. On sélectionnera les bactéries ayant intégré les plasmides en faisant pousser les colonies bactériennes sur un milieu contenant l'antibiotique X; les bactéries n'ayant pas intégré le plasmide ne se développeront pas. Cette technique est déjà grandement utilisée pour la production de somatostatine, hormone de croissance, humaine. Avant la connaissance de cette méthode, l'hormone était récupérée sur les morts, engendrant de nombreux problèmes de transmission de pathologies non repérées sur les cadavres prélevés. Depuis que la production de celle-ci est effectuée par des bactéries modifiées génétiquement via les plasmides, les patients souffrant d'un déficit d'hormone de croissance peuvent bénéficier de ces protéines qui leur manquent sans ce risque de transmission inter-humaine. Des tests sont également en cours pour la production d'un médicament contre les troubles liés à la mucoviscidose, maladie génétique pour laquelle la biomédecine manque pour le moment de soins efficaces.
Il est également possible de produire des protéines d'intérêt par des cultures eucaryotes, mammifères en particulier. Cela présente l'avantage de disposer de la machinerie de modifications post-traductionnelles telles que la glycosilation, absente chez les procaryotes. Or pour la plupart des protéines relativement complexes, celles-ci ne deviennent bioactives qu'une fois ces modifications opérées. Il est possible d'effectuer ces modifications à l'issue d'une production par une culture procaryote, mais cela reste encore fort complexe et exigent.
Application pour le séquençage
Cette application est particulièrement utile en génie génétique pour le séquençage d'ADN : l'ADN d'une cellule quelconque est difficile à séquencer car il dépasse très souvent 400 000 kb (1 kilobase = 1 000 bases) et se trouve en faible quantité. Ainsi, pour rendre le séquençage plus facile, on découpe l'ADN à analyser et l'ADN plasmidique avec une enzyme de restriction, dans des conditions spécifiques ; l'ADN à séquencer va s'intégrer dans l'ADN plasmidique. Le plasmide recombinant sera transféré dans le hyaloplasme bactérien. Une fois mise en culture, la bactérie va répliquer l'ADN plasmidique (et donc le fragment à séquencer) en grande quantité. Après avoir extrait l'ADN à séquencer, et éliminé le reste d'ADN plasmidique par des enzymes de restriction, on récupère les fragments d'ADN reproduits à plusieurs milliers d'exemplaires, que l'on peut alors séquencer facilement.
Notes et références
- J. Lederberg, 1952, Physiol. Rev. 32, 403-430.
- Watanabe T., Infective heredity of multiple drug resistance in Bacteria. Bacteriol Rev 1963;27:87-115
