Utilisateur:Polaert/CRT

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Modèle du complexe réplicase-transcriptase d'un coronavirus (SARS-CoV). En amont du complexe, un anti-génome du SARS-CoV-2 entre dans le CRT, sous l'impulsion d'une hélicase, aidée par une pince coulissante ARN pour la processivité et par un domaine primase pour l'amorçage (vert / orange). Cet anti-génome sert de modèle à répliquer pour la RdRp (rouge). En aval du CRT se trouvent une ExoN pour la relecture (bleu foncé), un cofacteur ExoN (jaune), et enfin une RBP pour éviter la structure secondaire (bleu clair)

Le Complexe Réplicase-Transcriptase (CRT) du SARS-CoV-2 est indispensable à la réplication en série du génome viral.

Le génome du SARS-CoV-2 est constitué d'un brin d’acide ribonucléique (ARN). Un ARN est un assemblage de quatre ribonucléotides : l'adénosine monophosphate (A), la guanosine monophosphate (G), l'uridine monophosphate (U) et la cytidine monophosphate (C). L’ARN du SARS-CoV-2 est composé de près de 30 000 ribonucléotides (A.G.U.C).

Lorsque le SARS-CoV-2 infecte une cellule, il injecte à l’intérieur de la cellule son ARN viral. L'ARN viral est lu par les ribosomes de la cellule hôte. Chaque combinaison de trois ribonucléotides est traduite par les ribosomes en un acide aminé spécifique. Le vivant compte 20 acides aminés, aussi il existe 20 combinaisons possibles de ribonucléotides. L’assemblage d'une succession d'acides aminés par les ribosomes forme des protéines virales, programmées pour remplir des missions bien spécifiques. En l’occurrence, une fois synthétisées par les ribosomes, une grande partie des 16 protéines non structurales (nsp) du SARS-CoV-2 s'assemblent pour former le Complexe Réplicase-Transcriptase (CRT).

Au sein du CRT, nsp12 est centrale. Nsp12 est une ARN polymérase ARN-dépendante nommée réplicase (RdRp), dont la première action est de synthétiser un brin d'ARN négatif, c'est-à-dire une copie à l'envers de la totalité du génome du virus, appelée antigénome. À partir de cet antigénome, Nsp12 reproduit en série des brins d'ARN positifs, autrement dit des reproductions dans le bon sens du génome viral. En amont du CRT, nsp13, nsp7 et nsp8 forment une pince coulissante ARN qui permet de dérouler l'ARN viral à recopier. En tant que hélicase, nsp13 sert de moteur moléculaire permettant de faire circuler l'anti-génome au sein du CRT. En aval du CRT, nsp14 avec l'aide de nsp10, relit les copies et corrige les erreurs de nsp12. Nsp16 joue un rôle important avec l’aide de nsp14 dans la formation de la coiffe des ARNs à son extrémité 5'. Nsp15 pourrait avoir un rôle de 'nettoyeur' dans la mesure où il est capable de dégrader les débris d'ARN. Enfin nsp9 est la protéine de liaison à l'ARN en sortie du complexe.

Nsp12[modifier | modifier le code]

Structure du complexe RdRp du SARS-CoV-2

La nsp12 est composée de 932 acides aminés, subdivisable en deux grands domaines fonctionnels : la RdRp et le NiRAN.

RdRp[modifier | modifier le code]

Activité polymérase[modifier | modifier le code]

La RdRp est une enzyme codée par toutes les familles de virus à ARN à l'exception des rétrovirus (comme le VIH). La RdRp « catalyse » autrement dit régule le processus de synthèse d'ARN viral à l'aide d'un mécanisme dépendant de deux ions de magnésium (Mg2+) ou de manganèse (Mn2+). Pour mener à bien son activité polymérase, c’est-à-dire répliquer des copies de l’ARN viral, la RdRp a besoin :

  • d'une matrice d'ARN, en l’occurrence un anti-génome, qui sert de modèle pour la réplication. Cet anti-génome circule au sein de nsp12 dans le tunnel principal ;
  • de deux ions de magnésium (Mg2+) ou manganèse (Mn2+) positionnés entre les trois acides aspartiques D618, D760, et D761[1]. En présence de deux ions Mg2+ ou Mn2+, les ribonucléotides triphosphates (rNTP) s'hydrolysent et se transforment en ribonucléotides monophosphates (rNMP). Ces deux ions sont placés sur le « site actif » principal où se croisent deux tunnels : le premier tunnel fait circuler l'anti-génome et assure la sortie d'un ARN double brin (anti-génome + copie du génome dans le bon sens), le second tunnel achemine les ribonucléotides triphosphates.[2]
  • de ribonucléotides triphosphates (ATP, GTP, UTP et CTP) qui ont un double rôle :
  1. Les ribonucléotides triphosphates sont une source d’énergie pour le CRT, dans la mesure où le détachement d'un phosphate du reste de la molécule génère de l'énergie.
  2. Les ribonucléotides monophosphates (A, G, U et C) issus des ribonucléotides triphosphates après déphosphorylation, servent de monomères et forment, une fois assemblées, les copies de l’ARN viral.

La RdRp aurait la forme d’une ‘main droite’ avec trois sous-domaines : les « doigts » (fingers), le « pouce » (thumb) et la « paume » (palm). La paume de la RdRp contient le site actif catalytique. Les doigts et pouce de la RdRp abritent les deux tunnels qui se rejoignent sur le site actif.

Motifs de la RdRp[modifier | modifier le code]

Les sept « motifs » de la RdRp du SARS-CoV-2

L'ossature des deux tunnels est un enchevêtrement de sept « motifs », autrement dit de sept séquences d'acides aminés de la RdRp. Ces motifs servent à orienter à la fois l'anti-génome et les ribonucléotides triphosphates (NTP) jusqu'au site actif où est assemblée une nouvelle copie d'ARN viral.

  1. Motif A : NPHLMGWDYPKCDRAMP (acides aminés n°611-627 de la nsp12) – Mn2+/Mg2+ (D618) dNMP/NMP (D623)
  2. Motif B : TSSGDATTAYANSVFNICQAVTANVNALLST (acides aminés n°680-710) - dNMP/NMP (S682 et N691)
  3. Motif C : FSMMILSDDAVVCFN (acides aminés n°753-767) – Mn2+/Mg2+ (D760 et D761)
  4. Motif D : LVASIKNFKSVLYYQNNVFMSE (acides aminés n°775-796) -H+ (K780 et K783)
  5. Motif E : HEFCSQHTMLVK (acides aminés n°810-821)
  6. Motif F : TITQMNLKYAISAKNRARTVAGV (acides aminés n°538-560) - TP (K545, K551, R553 et R555)
  7. Motif G : KSAGFPFNKWGKAR (acides aminés n°500-513)

L'entrée du tunnel à NTP est au niveau du motif F. Le motif F contient quatre acides aminés basiques chargés positivement (K545, K551, R553 et R555) qui interagissent avec les ribonucléotides triphosphates (NTP) via les fragments triphosphates (TP) qui eux sont chargés négativement.[3],[4]. Les NTP sont ensuite déphosphorylés par les ions de magnésium (Mg2+) ou manganèse (Mn2+) qui se trouvent à la jonction entre les motifs A et C (D618, D760 et D761). Lors de cette étape, le motif D pourrait contribuer à la déphosphorylation via K780 et K783, deux lysines ayant la capacité de déprotoner[5]. Avant d'être incorporés au brin d'ARN viral en formation, les nucléotides monophosphates sont triés en deux groupes par l'acide aspartique D623 du motif A. D623 distingue les ribonucléotides des désoxyribonucléotides. Seuls les ribonucléotides, molécules précurseurs de l'ARN, sont retenus. A contrario, les désoxyribonucléotides, molécules précurseurs de l'ADN, sont écartés.[5] Il est suggéré que cette action de tri pourrait également être assurée par la sérine S682 ou l'asparagine N691 du motif B[6]. Enfin le motif E n'interviendrait que pour amorcer de nouveaux brins d'ARN à synthétiser[5].

Quant à l'anti-génome, il circule sur le site actif à travers un sillon formé par les motifs F et G[7].

NiRAN[modifier | modifier le code]

Le NiRAN est considéré comme une « nucléotidyltransférase » c’est-à-dire une enzyme phosphotransférase qui pratique la phosphorylation ou la déphosphorylation à l'aide d’un ion de magnésium (ou manganèse) localisé entre l'asparagine N209 et l'acide aspartique D218[8]. L'activité catalytique du NiRAN est structurée par trois motifs :

  1. le motif AN : KRHTFSNYQHE (acides aminés n°73-83 de la nsp12)
  2. le motif BN : RQRLTKYTMAD (acides aminés n°116-134)
  3. le motif CN : TLDNQDLNGNWYDF (acides aminés n°206-219) – Mn2+/Mg2+ (N209 et D218)

Guanylyltransférase[modifier | modifier le code]

Le NiRAN est un « site actif » secondaire essentiel pour la réplication de l'ARN viral. Il remplit des missions différentes par rapport au site actif principal de la RdRp. Trois fonctions possibles ont été proposées pour l'activité de nucléotidylation du NiRAN. Il est suggéré que le NiRAN pourrait être :

  1. l'enzyme ARNm guanylyltransférase contribuant au coiffage 5' des ARNm, ce qui impliquerait une forte affinité du site actif du NiRAN pour le guanosine triphosphate (GTP)[9],[8]. Curieusement, alors que chez les autres coronavirus comme le HCoV-229, le site actif du NiRAN est réputé avoir une affinité plus forte pour l'UTP et le GTP que pour les autres NTP, le NiRAN du SARS-CoV-2 lui ne semble pas avoir une préférence pour un substrat en particulier[9].
  2. à l'origine de l'amorce de la synthèse d’un brin complémentaire d'ARN, c'est-à-dire de l’antigénome.[10],[9]
  3. une « ligase » capable de réparer l’anti-génome ou une copie d’ARN en créant de nouvelles liaisons covalentes entre deux morceaux d'ARN[9].

Tunnel avec nsp9[modifier | modifier le code]

En plus de ces activités, le NiRAN du coronavirus alimente nsp9 en nucléotides diphosphates (générées à partir de NTP). Nsp9 est une protéine mystérieuse qui se lie aux copies d'ARN viral en sortie du complexe RdRp. Le NiRAN interagit par intermittence avec nsp9.[10] Lors de sa liaison avec nsp9, une épingle à cheveux bêta localisée aux acides aminés V31-K50 de nsp12, forme avec les acides aminés de nsp9, un tunnel chargé positivement qui relie le site actif du NiRAN à nsp9. Par liaison phosphoramidate, l'asparagine N1 de nsp9 fixe alors des NDP qui viennent d'être catalysés par le NiRAN[8]. Le tunnel à NDP qui relie le NiRAN à nsp9 est actif lorsque deux régions se lient ensemble :

  1. dans la région 1 : l'asparagine N2 de nsp9 forme des liaisons hydrogène avec l'acide aspartique D36 de l'épingle à cheveux bêta du NiRAN et les acides aminés Y728 et R733 de la paume de la RdRp.[8]
  2. dans la région 2 : les acides aminés V202-V204-I223-V231 de nsp12 établissent des contacts hydrophobes avec les leucines L4 et L103 de nsp9. Tandis que l'asparagine N96 de nsp9 entre en contact avec l'acide aspartique D291 de nsp12 et forme des liaisons hydrogène avec les composés carbonylés P232 et Y289 de nsp12.[8]

Lorsque que le tunnel avec nsp9 est actif, l'activité guanylyltransférase du NiRAN est inhibée[8].

Clusters fer-soufre[modifier | modifier le code]

Le fer ferreux entre par la mitoferrine puis est pris en charge par le complexe ISC qui l’accouple à un atome de soufre inorganique pour former des centres Fe-S. HSC20 aide ces nouveaux centres Fe-S à s’intégrer dans des protéines mitochondriales à centre Fe-S. Cependant, ce dernier peut aussi sortir de la mitochondrie par ABCb7 pour être pris en charge par la CIA permettant la maturation des protéines à centre Fe-S. Nsp12 serait capable d'interagir avec HSC20 pour s'approvisionner en fer et souffre.

Deux doigts de zinc ont été proposés pour la nsp12 : l'un serait positionné sur le NiRAN entre les acides aminés H295-C301-C306-C310, l'autre serait localisé sur le RdRp à proximité du principal site actif catalytique entre les acides aminés C487-H642-C645-C646[11]. En réalité il s'agirait plutôt de deux clusters 4Fe-4S (fer-soufre). L'approvisionnement en fer et soufre serait assuré par HSC20, une protéine de la cellule hôte capable de puiser du fer et du souffre dans les mitochondries[12].

Les clusters Fe-S ne participent pas à la catalyse mais ont un rôle 'architectural' qui contribue à faciliter la liaison de l'enzyme à l'anti-génome et/ou à d'autres composants du complexe de réplication, en augmentant notamment la processivité de nsp12. Le clusters Fe-S du NiRAN facilite notamment l'interaction avec l'hélicase nsp13. Enfin ils facilitent la réparation grâce à un mécanisme de transfert de charge[12].

Amont CRT[modifier | modifier le code]

Au-delà de la seule nsp12, le « complexe RdRp » comprend une nps7, une paire de nsp8 (nsp8-1 et nsp8-2), une nsp12 et une paire de nsp13 (nsp13-1 et nsp13-2). L'assemblage du CRT est le suivant :

  • l'emboitement de nsp13-1 avec nsp8-1 se traduit par :
    1. deux liaisons hydrogène formées entre l'asparagine N46 de nsp13-1 et la glutamine Q73 de nsp8-1, et entre la tyrosine Y93 de nsp13-1 et la tyrosine Y71 de nsp8-1 ;
    2. une liaison hydrophobe de la methionine M70 de nsp8-1 avec la phénylalanine F80 et la leucine L91 de nsp13-1.
  • l'enchâssement de nsp13-1 avec nsp12 se fait via une double liaison entre le domaine « 1B » de nsp13-1 et le domaine « interface » de nsp12 :
    1. l'histidine H320 de nsp13-1 se lie à l'arginine R365 de nsp12
    2. la glutamine Q194 de nsp13-1 se lie à l'histidine H362 de nsp12
  • l'articulation de nsp13-1 avec nsp13-2 se fait au niveau de leur domaine « 1B » :
    1. la threonine T216 de nsp13-2 se lie à l'arginine R248 et à la valine V247 de nsp13-1
    2. la tyrosine Y217 de nsp13-2 forme une liaison hydrogène avec l'acide glutamique E244 de nsp13-1

Nsp13[modifier | modifier le code]

Amont du Complexe Réplicase-Transcriptase (CRT) du SARS-CoV-2

Les hélicases comme nsp13 sont censées être des moteurs moléculaires utilisant l'énergie libérée par l'hydrolyse des NTP pour[13] :

  • catalyser la rupture des liaisons hydrogènes entre une paire de bases nucléotiques, autrement dit scinder une ARN en double brin en un anti-génome et un brin d'ARN ;
  • dérouler l'anti-génome et le faire circuler au sein du CRT.

Le CRT comporte deux hélicases :

  • nsp13-2 pourrait se trouver en amont de la RdRp. L'anti-génome serait déroulé par nsp13-2 jusqu'au site catalytique actif de nsp12 dans une direction 3' à 5'[14] ;
  • nsp13-1 se trouverait en aval de la RdRp. Nsp13-1 fait circuler l'anti-génome dans une direction 5' à 3', autrement dit dans le sens inverse de nsp12. Il est suggéré que nsp13-1 joue un rôle dans la correction des copies d'ARN ou contribue à changer de modèle d'anti-génome[15],[16].

Nsp13 a sept motifs pouvant être classés en trois catégories. Il est proposé que les motifs I et II fixent et acheminent les NTP au site catalytique où un ion de manganèse (S289) assure la déphosphorylation. Les motifs Ia, Ib et IV seraient des motifs de liaison au double brin d’ARN qui casseraient les liaisons hydrogènes liant l’anti-génome à un simple brin d’ARN. Enfin les motifs III, IV et VI participeraient au mécanisme de couplage entre hydrolyse du NTP et changement conformationnel, couplage conduisant au déroulement de la double hélice et au déplacement de brins dont l’anti-génome au sein du CRT[13],[15] :

  1. Motif I : LQGPPGTGKS (acides aminés n°280-289 de la nsp13) – Mn2+/Mg2+ (S289)
  2. Motif Ia : TACSHAA (acides aminés n°307-313)
  3. Motif II : DEIS (acides aminés n°374-377)
  4. Motif III : IGDPAQLPAPRTL (acides aminés n°399-411)
  5. Motif IV : ISPYNSQNA (acides aminés n°512-520)
  6. Motif V : VDSSQGSE (acides aminés n°533-540)
  7. Motif VI : VAITRAKV (acides aminés n°563-570)

Nsp7[modifier | modifier le code]

Nsp8[modifier | modifier le code]

Aval CRT[modifier | modifier le code]

Notes et références[modifier | modifier le code]

Notes[modifier | modifier le code]

Références[modifier | modifier le code]

  1. ↑ (en) Khaled Barakat, « A “Deep Dive” into the SARS-Cov-2 Polymerase Assembly: Identifying Novel Allosteric Sites and Analyzing the Hydrogen Bond Networks and Correlated Dynamics », bioRxiv,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  2. ↑ (en) Francesca Picarazzi, « Targeting the RdRp of Emerging RNA Viruses: The Structure-Based Drug Design Challenge », Molecules,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  3. ↑ (en) Qi Peng, « Structural Basis of SARS-CoV-2 Polymerase Inhibition by Favipiravir », Innovation (N Y).,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  4. ↑ (en) Brandon Malone, « Structural basis for backtracking by the SARS-CoV-2 replication–transcription complex », PNAS,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  5. ↑ a b et c (en) Rodrigo Jácome, « Structural Analysis of Monomeric RNA-Dependent Polymerases: Evolutionary and Therapeutic Implications », PLoS One.,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  6. ↑ (en) Hauke S. Hillen, « Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase », Nature,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  7. ↑ (en) YAN GAO, « Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus », SCIENCE,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  8. ↑ a b c d e et f (en) Liming Yan, « Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis », Cell.,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  9. ↑ a b c et d (en) Bing Wang, « NMPylation and de-NMPylation of SARS-CoV-2 nsp9 by the NiRAN domain », Nucleic Acids Research,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  10. ↑ a et b (en) Heiko Slanina, « Coronavirus replication–transcription complex: Vital and selective NMPylation of a conserved site in nsp9 by the NiRAN-RdRp subunit », PNAS,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  11. ↑ (en) Wanchao Yin, « Structural Basis for the Inhibition of the RNA-Dependent RNA Polymerase from SARS-CoV-2 by Remdesivir », SCIENCE,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  12. ↑ a et b (en) Nunziata Maio, « Fe-S cofactors in the SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase are potential antiviral targets », SCIENCE,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  13. ↑ a et b Muriel Uhring et Arnaud Poterszman, « ADN hélicases et maladies associées », MEDECINE/SCIENCES,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  14. ↑ (en) Liming Yan, « Architecture of a SARS-CoV-2 mini replication and transcription complex », Nature Communications,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  15. ↑ a et b (en) Ryan Weber, « Role of ATP in the RNA Translocation Mechanism of SARS-CoV-2 NSP13 Helicase », J Phys Chem B.,‎ (lire en ligne, consulté le ).
  16. ↑ (en) Joseph A. Newman, « Structure, mechanism and crystallographic fragment screening of the SARS-CoV-2 NSP13 et nsp helicase », Nature Communications,‎ (lire en ligne, consulté le ).
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