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CULTURE IN VITRO[modifier | modifier le code]
La culture in vitro est un processus qui consiste à introduire des explants sur un milieu artificiel connu. Les cellules contenues dans ces explants sont donc maintenus en vie hors de leur milieu naturel.
Pour faire de le culture in vitro, il faut travailler dans des conditions stériles, aseptiques et axénique. Il faut également manipuler dans un espace réduit et dans un environnement contrôlé afin de travailler sans agents pathogènes.
Histoire[1][modifier | modifier le code]
En 1902 - G.HABERLAND énonce pour la première fois le concept de totipotence cellulaire. Il parvient à faire survivre quelques mois des petits amas de cellules grâce à la technique de culture in vitro.[2]
En 1922 - W;J ROBBINS (Etats-Unis) et W.KOTTE (Allemagne) obtiennent la croissance de pointes de racines pendant quelques mois.
En 1935 - R.J GAUTHERET (France) cultive et multiplie des cellules cambiales de Saule en introduisant des auxines dans le milieu
En 1952 - G. MOREL et C. MARTIN régénèrent des plantes entières de Dahlia à partir de cultures de méristèmes de plants infectés par des virus différents.
En 1957 - F. SKOOG et C.O MILLER régénèrent des racines et des tiges à partir de cals à l'aide d'auxines et de cytokinines.
En 1962 - T. MURASHIGE et F. SKOOG mettent en place le milieu MS très utilisé aujourd'hui pour la culture in vitro. Il l'utilise sur des cultures de tissus de tabacs. Le milieu MS est composé de sels minéraux, de vitamines B, de sucres et de phytohormones.
En 1976 - L.H SAN NOEUM réussit la première culture d'ovaires d'orges non fécondés.
En 1983 - M. Van MONTAIGU et COLL créent les premières plantes transgéniques, transformées par Agrobactérium tumefaciens,
Utilisations[3][modifier | modifier le code]
Le but principal des agriculteurs est d’améliorer leur plantes grâce à cette technique. La majorité des plantes que l’on consomme au jour d’aujourd’hui n’existaient pas il y a quelques années. La majorité des plantes sont des cultivars : ce sont des plantes ayant vu le jour dans les années 1960.
La culture in vitro permet également de produire les plantes en plus grande quantité et beaucoup plus rapidement. Pour obtenir des plantes plus rapidement, on peut également utiliser la multiplication végétative qui peut être naturelle ou provoquée tels que la marcottage ou le bouturage[4].
Cette technique permet d’assainir les végétaux des agents pathogènes. On s’en sert également pour faire de la recherche.[5]
Conditions de travail[modifier | modifier le code]
Les conditions de travail sont des éléments très importants car ce sont ceux qui contribue à la bonne réussite de la culture.
Choix de l'explant [modifier | modifier le code]
Un explant est un fragment de plante : on peut alors cultiver un fragment de feuille, de tige,de racine ou de fruit par exemple.L'explant doit être stérilisé afin qu'il ne soit pas contaminé et qu'il soit le plus sain possible.
Cependant, il faut veiller à bien choisir son explant car certaines espèces, tels que les ligneux, sont difficiles à cultiver en in vitro : on les appelles les espèces résistantes. Au contraire, certaines espèces sont très simple à cultiver : on les appelles les espèces flexibles.
Des organes sont plus facilement cultivables que d'autre. Pour savoir quel organe est simple à cultiver en in vitro, il faut regarder son niveau de ploïdie. La limite de culture se situe à 8n. Pour obtenir un bonne culture in vitro, il faut, au maximum, avoir du 3n. Les racines, qui sont généralement 6n ou 8n, sont très difficiles à cultiver.
Milieu de culture[modifier | modifier le code]
Le milieu de culture de l'explant est très important. Il doit être connu afin de savoir quels sont les conditions dans lesquels cet explant va se développer.Le milieu de culture le plus utilisé est le milieu MS (crée par MURASHIGE et SKOOG).
Avant tout, il faut que ce milieu de culture soit assainit de tout agent pathogène possible. Pour cela, ce milieu est stérilisé dans un autoclave.
Dans le milieu, il faut tout les éléments qui sont importants pour la plantes. Il lui faut : des sels minéraux, une source d'énergie, des vitamines et des phytohormones.
- Pour les sels minéraux, on distingue des micro-éléments et des macro-éléments.
- Les macro-éléments sont des substances dont la plantes à besoin en grande quantité afin de pouvoir se développer correctement : on y trouve du potassium, du calcium, du magnésium, du soufre, du phosphate et du sodium.Tous ces macro-éléments ont des rôles différents mais tous sont utilises au développement de la plante.
- Les micro-éléments sont des substances dont la plante à besoin en quantité plus petite : on y trouve du fer, du cobalt, du manganèse, du cuivre, du zinc et du nickel.[6] Ces micro-éléments sont également appelés "oligoéléments". Ils sont utilisés comme catalyseurs ou dans des réactions chimiques tel que l'oxydoréduction.
- En in vitro, un végétal est hétérotrophe, c'est à dire qu'il ne peut pas synthétiser sa propre matière.Il faut donc lui ajoute une source carbonée.C'est pourquoi on lui ajoute donc du saccharose car l'explant ne peut pas assurer sa photosynthèse. C'est donc ce saccharose qui va lui permettre de la relancer. De la même façon, les végétaux en in vitro ne synthétisent pas leur vitamines : on lui ajoute alors des vitamines B3, B1 et B8.
- On ajoute des phytohormones car le végétal ne les synthétisent pas en in vitro. De plus, elles sont essentielles pour les mitoses et donc pour le développement de la plante. Il existe différent groupe de phytohormones : les auxines, les cytokinines, les gibbérelline, l'éthylène et l'acide abscissique. Les auxines et les cytokinines sont néanmoins les plus utilisés en culture in vitro.
- On ajoute de l'agar agar afin de solidifier le milieu.
Facteurs environnementaux[modifier | modifier le code]
Pour faire de la culture in vitro, il faut prendre en compte les facteurs environnementaux tels que la consistance du milieu, le ph, la lumière, la température, l’aération, l’humidité et les conditions environnementales.
On peut travailler sur un milieu liquide, solide ou avec des roches poreuses.
ph[modifier | modifier le code]
Le pH doit être contrôlé car il est essentiel pour la solubilité des sels minéraux, pour l’auxèse et pour éviter l’hydrolyse de l’agar. Si le pH est compris entre 5 et 6,5 ; alors la croissance végétale sera optimale.
lumière[modifier | modifier le code]
La lumière est également très essentielle pour le développement et la croissance du végétal. En effet, si la plante n’est pas exposée à la lumière, alors elle ne peut pas effectuer sa photosynthèse. Elle consacre alors toute son énergie à chercher la lumière : c’est l’étiolement. Au début de la culture, l’explant ne fait pas de photosynthèse car il n’y a pas de feuilles. Une fois que les feuilles apparaissent, il faut pouvoir contrôler l’intensité lumineuse (valeur optimale : 5 à 25W/m²), la longueur d’onde (valeur optimale : 600nm) et la durée d’éclairage (photopériode). Certaines plante ont plus besoin d’obscurité tandis que certaines ont besoin d‘une quantité plus grande de lumière. On les appelle respectivement plantes de jour court et plante de jour long.
température[modifier | modifier le code]
La température est variable selon l’espèce, elle se situe généralement entre 20 et 25°C.
aération[modifier | modifier le code]
Il faut contrôler l’aération et l’humidité. En effet, il faut que l’explant ait suffisamment d’espace pour se développer. Les tubes sont fermer avec des bouchons percés afin d’éviter que la plante s’asphyxie. Dans la nature, un végétal se dessèche très vite mais pas en in vitro.
conditions[modifier | modifier le code]
Pour travailler dans de bonnes conditions, les milieux doivent être autoclavés. Le manipulateur doit se laver les mains et les bras au détergent, à l’eau puis à l’alcool afin d’éviter tout agent pathogène possible. Il doit également porter un certains nombre d’accessoires pour optimiser les chances d’obtenir des bons résultats, c'est-à-dire blouse, gants, lunettes, charlotte, house de chaussures. Il travaille sous une hotte nettoyée préalablement.
Les instruments utilisés sont, au préalable, nettoyer et stérilisés.
Techniques [7] [modifier | modifier le code]
La culture in vitro se fait en 4 temps :[8]
1-L’initiation : il s’agit du choix de l’explant. C’est l’étape de préparation des milieux et de mise en culture de l’explant. C’est l’étape la plus délicate à faire car si un faux pas est commis, c’est toute la culture qui rate.
2-La multiplication : c’est l’étape où l’explant se multiplie.
3-L’enracinement : Il s’agit de la formation des racines.
4-L’acclimatation : Cette étape consiste à préparer l’explant à affronter les conditions extérieures.
Pour faire de la culture in vitro, on peut utiliser différents moyens tels que :
- la culture de méristème: technique permettant d'extraire un méristème, de le cultiver et d'obtenir par la suite une plante.
- la micro-propagation: C'est une technique utilisée permettant d'acquérir, à partir d'une plante mère, de nombreuses plantes filles toutes identiques, dans un temps restreint.[9]
- l’embryogenèse somatique: Cette technique permet la formation d'embryon à l'aide de cal ou de suspensions cellulaires.
- l'haplodiploidisation avec androgenèse et gynogenèse : visant à obtenir de nombreuses gamètes diploïde à partir d'appareils reproducteurs (androgenèse pour les mâles et gynogenèse pour les femelles) diploïdes ou à partir de gamètes haploïdes.
- la culture de proplastes: technique visant a supprimer la paroi d'une cellule végétative grâce à des actions mécanique ou chimique.
- la régénération d'organes avec une néoformation directe ou indirecte : C'est la croissance d'explants (tige ou racines) en fonction des concentrations et du rapport auxines et cytokinines. Cette régénération peut donner lieu à la formation de cal si les concentrations d'auxines et de cytokinines sont égales.
références[modifier | modifier le code]
- « historique », sur technivit.pagesperso-orange.fr (consulté le )
- Encyclopædia Universalis, « Universalis : authentification », sur www.universalis-edu.com (consulté le )
- « Quels sont ses buts ? », sur totipotence-cellulaire.e-monsite.com (consulté le )
- http://documents.irevues.inist.fr/bitstream/handle/2042/25750/RFF_1986_S_60.pdf?sequence=1
- R. Augé, G. Beauchesne, J. Boccon-Gibod, La culture in vitro et ses applications horticoles, Paris, J. B. Baillière, (ISBN 2-85206-504-5)
- http://lyc89-larousse.ac-dijon.fr/IMG/pdf/culture_in_vitro.pdf
- « techniques », sur technivit.pagesperso-orange.fr (consulté le )
- « La culture in vitro », sur youtube, (consulté le )
- « Plant Tissue Culture : micropropagation », sur youtube, (consulté le )