ATPmétrie

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L'ATPmétrie est une technique de biologie moléculaire, basée sur le principe de la bioluminescence, qui permet de mesurer la quantité d'ATP présente dans un échantillon, et qui a de nombreuses application (développées dans les années 1980) pour le contrôle microbiologique des eaux[1] ou diverses boissons (ex jus de fruits, vins[2],[3]) ou de divers aliments (ex : viande hachée[4],[5]).

Principe[modifier | modifier le code]

Schéma général des réactions de bioluminescences

Chez la luciole, la réaction de bioluminescence a lieu grâce à une activation préalable de la luciférine par l'hydrolyse d'adénosine triphosphate (ATP). Si les concentrations en luciférine-luciférase et en oxygène sont maintenues constantes, alors l'intensité lumineuse est proportionnelle à la quantité d'ATP. En utilisant la luciférine et la luciférase de la luciole, il est donc possible, grâce à un luminomètre, d'obtenir une évaluation de la quantité d'ATP dans un échantillon. La valeur obtenue en unité relative de lumière (URL ou RLU en anglais), permettra grâce à un étalon d'estimer la quantité d'ATP.

Eqbilanluciferine1.JPG

Intérêt[modifier | modifier le code]

L'ATP est la première source d'énergie de toute cellule vivante et l'on considère que chaque bactérie en contient environ 1 femtogramme. Il est alors possible grâce à cette méthode d'avoir une estimation instantanée de la biomasse totale contenue dans un échantillon en mesurant l'ATP intracellulaire : il faut alors filtrer l'échantillon et lyser les bactéries pour libérer leur ATP

Dans l'eau[modifier | modifier le code]

Cette méthode ne permet pas d'identifier les bactéries ou d'autre espèces. Mais elle offre un indicateur de niveau de risque de développement dans un milieu (eau en général) d'amibes et autres microorganismes, et donc de biofilms ou et de bactéries pathogènes comme les Légionelles[6],[7]. En effet, la colonisation des surfaces (paroi des conduites d'eau, des systèmes de climatisation) par de la biomasse ou des biofilms est un facteur important du risque de développement des Légionelles et d'autres bactéries comme Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.

La surveillance de la biomasse active permet donc d’estimer le risque et de le contrôler. Les coûts de charges d’une installation et son impact sur l’environnement sont ainsi réduits par l’optimisation de l’utilisation des biocides.

La rapidité de cette méthode permet un contrôle quotidien afin de réagir rapidement à toute variation de la biomasse dans une installation, contrairement aux méthodes classiques comme la culture cellulaire ou la PCR quantitative [8]

Dans le sang et les fluides biologiques[modifier | modifier le code]

Si l'ATP-métrie est opérationnelle pour mesurer l'ATP dans l'eau, elle est actuellement testée pour une application au sang, en particulier, et à d'autres fluides comme l'urine, afin de détecter précocement les risques d'infections d'origine bactérienne. La méthode se heurte aux nombreux inhibiteurs présents dans les liquides biologiques[9].

Extension de l’ATPmétrie[modifier | modifier le code]

Un engouement pour l'ATPmétrie est apparu il y a une vingtaine d'années avec la mise sur le marché de divers kits de dosages intégrés. Ces kits bien qu'apportant un certain confort (en termes de rapidité et de facilité d'utilisation) par rapport aux méthodes dites traditionnelles (5 minutes au lieu de 2880 minutes) donnaient cependant des résultats fortement erronés[réf. nécessaire] et difficilement interprétables en termes de risque sanitaire.

Les fabricants de kits de mesure ont mis au point de nouvelles techniques d’analyses : l’ATP-métrie quantitative. Elle permet de quantifier dans un échantillon d’eau la charge microbiologique présente par dosage de l’ATP. Le type de protocole appliqué se décompose en quatre étapes principales :

  1. La filtration : l’échantillon d’eau est filtré au travers d’une membrane de porosité 0,45µm qui permet de concentrer les microorganismes et augmenter le volume d’eau analysé (jusque 1 litre de prise d’essai contre 100µl sur les anciens tests au format « stylo »). Cette filtration permet aussi de discriminer l’ATP libre de l’ATP intracellulaire et d’éliminer les éventuelles molécules inhibitrices de la réaction enzymatique(ex : biocides, solutions acides & basiques,…).
  2. L’extraction : une solution de lyse est mise en contact avec les microorganismes retenus sur la membrane afin d’en extraire les molécules d’ATP. L’extrait est déposé dans un tube de mesure.
  3. La quantification : l’extrait d’ATP est mis en contact avec une solution enzymatique (luciférine / luciférase). La réaction décrite dans le paragraphe n°2 débute ; le tube de mesure est ensuite placé dans un luminomètre qui quantifiera le nombre de photons émis par la réaction. L’appareil rend un résultat en RLU (Relative Light Units).
  4. La calibration : un ajout dosé est introduit dans le milieu réactionnel afin de « calibrer » la réaction. Le tube de mesure est ensuite placé dans un luminomètre qui quantifiera le nombre de photons émis par la réaction. L’appareil rend un résultat en RLU. Ce standard d’ATP permet, par ajout dosé (quantité connue), une quantification de la concentration en ATP initialement présente dans l’échantillon et de prendre en compte l’éventuel effet inhibiteur de la matrice analysée. Les deux résultats rendus par le luminomètre permettent d’en déduire la relation entre RLU et concentration en ATP dans l’échantillon. Le résultat est rendu en picogramme d’ATP par millilitre (pgATP/ml) ou en équivalent bactérie par millilitre (eq.bact/ml) ; si on se base sur le consensus scientifique suivant : 1pgATP ≈ 1 000 bactéries.

Témoin Interne/ Nucléotides Adényliques[modifier | modifier le code]

Les résultats sont toujours en RLU (Relative Light Unit) et non en concentration réelle d'ATP. Or, on a montré :

Ajout dosé[modifier | modifier le code]

Selon le prélèvement, même sur un même site, les RLU pour une même quantité d'ATP peuvent varier de 1000%. On peut y remédier en grande partie par le témoin interne ou l'ajout dosé, sans que la manipulation soit ni plus longue et ni plus coûteuse.

Nucléotides Adényliques[modifier | modifier le code]

La concentration en ATP dans une cellule varie en fonction de son état physiologique, alors que pour une cellule "adulte" vivante le taux des Nucléotides Adényliques (NA) est constant. Il est donc utile de doser les concentrations en NA (ATP+ADP+AMP) intra et extra cellulaire. (Et ceci sans allonger le temps de réponse par rapport au dosage de l'ATP seul). Ainsi, non seulement nous augmentons le seuil de détection (Dans presque tous les cas étudiés à ce jour, on a gagné un facteur de 3 logs et même atteint un facteur de 5 logs).
Ceci s'explique par l'état physiologique de la biomasse dominante du milieu. Toute cellule vivante, à l'état de vie ralentie (spore par exemple), n'a pratiquement pas d'ATP mais beaucoup d'AMP. Ceci nous amène au deuxième point

Comparaison ATP métrie et méthode traditionnelle[modifier | modifier le code]

L'ATP et le dénombrement par milieu de culture ne sont pas comparables, car même si la corrélation est excellente en culture pure, en réalité les micro-organismes ne croissent pas sur les milieux de culture dit "flore totale" et l'on ne peut faire abstraction totale des anaérobies... alors que par le dosage des NA toutes les cellules vivantes (excepté les virus) sont mis en évidence…
Il y a aussi l'aspect de distinction des NA microbiens des autres cellules somatiques par exemple : des méthodes permettent de les différencier. Mais là est un autre débat car dans le cadre d'un contrôle d'hygiène par exemple, il est plus important de savoir s'il n'y a plus de résidu de matière "bio-organique" vivante, puisque l'on peut déterminer aisément les NA extracellulaires (donc les cellules mortes) des NA intracellulaires (donc des cellules potentiellement revivifiables)? Sur ce principe il est possible de mettre en évidence l'« efficacité » d’antiseptique, de détergent, d'antibiotique, de désinfectant, de fongicide, de phages, etc. en temps réel.

L' "ATP-métrie" est donc une excellente méthode pour montrer l'efficacité d'une technique de nettoyage mais à condition de ne pas se cantonner à des RLU. Le dosage en concentration de NA donne des informations en moins de 5 minutes sur les contaminations "bio-organiques", et donc entre autres la présence de micro-organismes avec leur état physiologique, quel que soit leur système trophique (aérobie ou anaérobie), ce que n'autorisent pas les méthodes traditionnelles (pour les anaérobies 28800 minutes contre 5 minutes).

  • Biochimiluminescence : principes et applications[10],[11].

Par rapport à l’"ATP-métrie" la NA-métrie non seulement permet la détection et le dosage global de la micro-biomasse de n'importe quels écosystèmes (naturels ou artificiels), mais aussi la quantification spécifique de n’importe quel microorganisme en temps réel et in situ.

Notes et références[modifier | modifier le code]

  1. Raymond M (2006). L'ATP-métrie: de nombreuses applications dans le domaine du contrôle des eaux. L'Eau, l'industrie, les nuisances, (297), 81-84.
  2. Ormières, J. F., Lurton, L., & Cao-Thanh, B. (2000). Controle microbiologique des vins: utilisation de l'ATP-metrie. In XXVème Congrès Mondial de la Vigne et du Vin: Paris 19-23 Juin/June/Junio 2000 (pp. 403-408). Office International de la Vigne et du Vin.
  3. Ormières, J. F., Lurton, L., & Cao-Thanh, B. (2000). Controle microbiologique des vins: utilisation de l'ATP-metrie. In XXVème Congrès Mondial de la Vigne et du Vin: Paris 19-23 Juin/June/Junio 2000 (pp. 403-408). Office International de la Vigne et du Vin.
  4. Bruchon, M. (1991). Estimation de la qualité microbiologique des viandes hachées par ATP-métrie. Viandes et produits carnés, 12(1), 17-20 (résumé).
  5. Grand, B. (1983). Evaulation de la contamination microbienne superficielle des viandes par ATP-Metrie, utilisation d'un photomultiplicateur. École Nationale Veterinaire.
  6. Garrelly L & Raymond M (2007) L'ATP-métrie: un outil de surveillance en temps réel du risque légionelles sur les tours aéroréfrigérantes et réseaux d'eaux. L'Eau, l'industrie, les nuisances, (298), 53-56.
  7. Magdo, C. (2008). Maîtrise du risque légionelle: Mise en place d'un suivi de la biomasse active par ATP-métrie sur des circuits de refroidissement. TSM. Techniques sciences méthodes, génie urbain génie rural, (résumé).
  8. Biologie des eaux : méthodes et techniques 1988-1994 Champiat. D, Larpent JP Ed : Masson
  9. Biochimiluminescence and biomedical applications 1994 D. Champiat & al Cell Biology and Toxicology Volume 10, Numbers 5-6,
  10. 1993 D. Champiat & J.P Larpent Biotechnologies Masson 1993 531 p
  11. Applications of biochemiluminescence to HACCP 2001 Dominique Champiat & Al Luminescence Volume 16, Issue 2, pages 193–198, March/Avril 2001

Voir aussi[modifier | modifier le code]

Articles connexes[modifier | modifier le code]

Brevets[modifier | modifier le code]

  • ATP-metry for detecting and counting viruses D. Champiat 2004
  • ATP-metry based on intracellular Adenyl Nucleotides for detecting and counting cells, use and implementing method for determining bacteria in particular devoid of ATP. D.Champiat 2004

Bibliographie[modifier | modifier le code]

  • De Zutter, L., & Houf, K. ATPmétrie: une méthode rapide pour évaluer l'efficacité du nettoyage et de la désinfection dans l'industrie alimentaire. Résumés du Colloque de Société Française de Microbiologie, Section de Microbiologie des Aliments, Parijs (Frankrijk), 1999, 34.
  • Floriot M (2008) Application de l'ATPmétrie à l'épuration par voie biologique. L'Eau, l'industrie, les nuisances, (309), 78-81.
  • Garrelly L & Raymond M (2007) L'ATP-métrie: un outil de surveillance en temps réel du risque légionelles sur les tours aéroréfrigérantes et réseaux d'eaux. L'Eau, l'industrie, les nuisances, (298), 53-56.
  • Minvielle, B. (2000). Contrôle du nettoyage et de la désinfection: L'ATP-métrie en complément du contrôle microbiologique. Viandes et produits carnés, 21(1), 11-18 (résumé)
  • Minvielle, B., & Rugraff, Y. (1999). Interet de l'ATP-metrie pour la validation et l'optimisation du nettoyage-desinfection dans le secteur abattage-decoupe. TECHNIPORC, 22, 5-10.
  • Oulahal Lagsir, N. (2000). Procédé intégré de quantification de biofilms résiduels des industries agro-alimentaires. Décrochage mixte: ultrasonique- enzymatique et couplage a lATP-métrie (Doctoral dissertation).
  • TODOROVA, V., & RAYMOND, M. (2008). BIOLOGIE: Application de l'ATPmétrie à l'épuration par voie biologique. Galvano organo traitements de surface, (778).