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Principe de la microscopie de fluorescence à feuille de lumière.

La microscopie de fluorescence à feuille de lumière (MFL) est une technique de microscopie de fluorescence non destructive. Une fine tranche (présentant une épaisseur allant de quelques centaines de nanomètres à quelques micromètres) de l'échantillon est illuminée perpendiculairement à la direction d'observation. L’illumination se fait par un rayon laser concentré sur une seule direction. Dans la mesure où seule la section observée est illuminée, cette méthode réduit les dégâts et le stress que peut engendrer une exposition à la lumière ; c'est pourquoi elle est bien adaptée pour imager des échantillons vivants[1], en comparaison à d'autres méthodes (microscopie confocale, microscopie de fluorescence plein champ, microscopie multiphotonique.). De plus, la bonne capacité de sectionnement optique réduit le signal de fond, ce qui permet l'obtention d'images avec un meilleur contraste (comparable à celui de la microscopie confocale). Enfin, la MFM scanne l'échantillon en utilisant non pas un point mais une feuille de lumière, elle fournit donc une vitesse d'acquisition rapide (100 à 1000 fois plus grande que les méthodes basées sur des points d'illumination).

Comparaison entre différentes modalités de microscopie (LSFM: MFL, WF: Microscopie plein champ, CF: microscopie confocale)

Historique[modifier | modifier le code]

Une première version de MFL (appelée ultramicroscopie) a été présentée dès 1903 par Siedentopf and Zsigmondy (1903). Dans de nombreuses techniques de microscopie, un chemin optique identique est utilisé pour l’illumination est l’observation de la lumière. Siedentopf et Zsigmondy ont apporté un changement à cela, en séparant les axes d’illumination et d’observation. Aussi, l’illumination était faite par une feuille de lumière. La lumière du soleil était alors projetée à travers une fente dans le but d’observer des particules d’or. L’observation de cette feuille fournissait alors une observation dans une direction perpendiculaire à celle de l’illumination. En 1994, un premier microscope à feuille de lumière, orthogonal-plane fluorescence optical sectioning (OPFOS) a été proposé par Voie, Burns et Spelman, et développé pour imager l’oreille interne d’un cobaye.[2] Cette méthode utilise le même principe que l’ultramicroscopie, mais pour des tissus. La séparation des axes d’illumination et d’observation combinée à l’illumination par un laser permet d’éclairer uniquement la surface plane observée. Cela évite notamment de blanchir les régions qui ne sont pas imagées. Un autre problème a dû être surmonté. De façon générale, les échantillons sont opaques : la lumière émise par le laser ne peut alors pas les sectionner (de façon optique). Spalteholz a décrit une méthode résolvant ce problème. Celle-ci permet de rendre transparent des tissus. Au moyen de mélange d’huiles, elle fait correspondre chaque indice de réfraction à travers le volume de l’échantillon avec l’indice de réfraction le plus proche de celui de la protéine. Cette méthode a été intégrée à l’OPFOS et est primordiale, pour atteindre des profondeurs dépassant quelques millimètres. Le développement de la MFL a été accéléré à partir de 2004, avec la publication dans Science du principe de microscopie à feuille de lumière (en anglais Single Plane Illumination Microscope ou SPIM) par Huisken et al..[3] L’instrument permet d’explorer le vivant en trois dimensions et se base sur le principe de la microscopie à feuille de lumière.

Description de la MFL[modifier | modifier le code]

Principe[modifier | modifier le code]

Dans la MFL, seule une fine tranche de l’échantillon est illuminée, et ce perpendiculairement à l’axe du système de d'observation.[4] Un MFL peut être considéré comme un assemblage de 4 unités de base, qui ont pour but d’éclairer l’échantillon par une feuille de lumière, de détecter la lumière émise, de déplacer l’échantillon et de procéder au traitement des données acquises. Le système d’illumination produit une feuille de lumière qui permet d’exciter les fluorophores. La feuille de lumière coïncide avec le plan focal du système de détection. L’illumination est faite par un rayon laser, dont il est possible de modifier le diamètre. Ce rayon entre alors dans un appareil optique (par exemple une lentille cylindrique) qui créé la feuille de lumière, ce qui permettra alors de produire la fluorescence dans une tranche de l'échantillon. La lumière fluorescente émise depuis la feuille de lumière est ensuite recueillie perpendiculairement par un capteur permettant la production d'images (par exemple une caméra CCD). Le système de détection consiste en un microscope à fluorescence plein champ. L’image se forme sur le capteur (par exemple une caméra CDD) via une lentille tubulaire. Le système de contrôle gère le processus d’acquisition des données et procède à leur traitement. La MFL bénéficie des nouvelles technologies de capteurs CCD qui fournissent un excellent rapport signal sur bruit et une grande sensibilité. Elle apporte donc plusieurs avantages par rapport aux techniques classiques de microscopie tridimensionnelle (confocale et multiphotonique). Elle est parfaitement adaptée à l’imagerie statique et dynamique d’échantillons avec une résolution subcellulaire. Il est nécessaire que la feuille de lumière et le plan focal du détecteur optique coïncident pour qu'une image se forme. Cela implique donc que pour observer plusieurs parties d'un échantillon, ce n'est pas l'objectif d'observation qui se déplace, mais l'échantillon. Le déplacement de l’échantillon peut généralement se faire par des translations selon les trois axes et des rotations selon l’axe vertical. Le tableau ci-dessous permet une comparaison entre différentes techniques de microscopie.[5]

Nom Signal Résolution Fluorescence Taille Durée d’imagerie Coût($) Photoblanchiment Source
Interference reflection microscopy Magnétique mm Non, agent de contraste m h Millions NA Lauterbur 1973
Tomographie CT Radioactif <mm Non, agent de contraste cm min Millions NA Kalender 2006
Microscopie confocale Laser <micron Oui micron msec 200 000 Oui Minsky 1961
2-Photon Laser <micron Oui mm msec 500 000 Moins Denk et al. 1990
MFL Laser micron Oui >cm msec 30 000 Le moins Voie et al. 1993

Photoblanchiment[modifier | modifier le code]

Les techniques de microscopie classiques (microscopie de fluorescence, microscopie confocale) illuminent l’échantillon dans sa totalité. Le sectionnement optique n’est pas obtenu par le processus d’illumination, mais pas mise en exergue de la fluorescence par une fente devant le détecteur. En conséquence, la plupart de la lumière émise n’atteint pas le détecteur. Concernant la formation des images, différents plans sont acquis en scannant tout l’échantillon à différentes positions suivant l’axe z. Cela fournit alors la répartition 3D de la fluorescence. En conséquence, l’exposition de l’échantillon à la lumière est très importante. Dans la MFL, c’est une pile d’images qui est acquise. Les éléments fluorescents en dehors du plan focal ne sont pas illuminés. Cela n’est pas le cas avec les autres techniques de microscopie, et les dégâts engendrés par l’exposition à la lumière (par exemple le photoblanchiment) sont donc réduits. Supposons qu’une feuille de lumière de 1,5 μm soit utilisée pour observe une cellule de 15 μm d’épaisseur. 10 plans sont nécessaires pour scanner la cellule. En microscopie confocale, pour chaque plan, toute la cellule est illuminée. Dans la MFL, seule la tranche de l’échantillon à la profondeur à laquelle on procède à l’acquisition. L’exposition est bien moins importante dans le second cas. Le facteur quantifiant cet écart entre ces techniques augmente avec la taille de l’échantillon (il est de 20 à 30 pour une cellule, et atteint jusqu’à 500 pour un échantillon). Cet avantage de la MFL permet alors des observations de durée plus longue ou encore des acquisitions avec un nombre de points plus importants.

Résolution[modifier | modifier le code]

Un MFL peut être vu comme la combinaison d’un système d’illumination et d’un système d’observation. Ainsi, sa résolution est directement liée à ces deux sous-systèmes, qui sont orthogonaux. On définit alors une résolution latérale et une résolution axiale. La résolution latérale est déterminée par le système de détection, et donc par la lentille utilisée. Elle est similaire à celle des techniques classiques de microscopie de fluorescence. Pour une ouverture numérique inférieure à 0,6, la résolution axiale dépend principalement de l’épaisseur de la feuille de lumière. Pour de faibles ouvertures, la résolution obtenue est meilleure que dans des techniques classiques de microscopie. Pour des ouvertures numériques importantes (Engelbrecht and Stelzer 2006), elle est similaire à celle obtenue par microscopie confocale. La résolution peut être améliorée en acquérant les images selon plusieurs directions. Parmi les techniques permettant d’obtenir des images selon plusieurs directions, certaines reposent sur l’utilisation de plusieurs lentilles indépendantes entre elles et pointant vers un même volume.[6] D’autres n’utilisent qu’une seule lentille. Il est alors procédé à une rotation de l’échantillon.[7] Les MFLs sont particulièrement adaptées à cette technique d’imagerie selon plusieurs directions. En effet, les échantillons ne sont pas insérés dans des lamelles, ce qui autorise leur rotation. De plus, les lentilles utilisées dans les MFLs sont à grande focale. Cela fournit alors suffisamment d’espace dans le microscope pour procéder à la rotation d’un spécimen estimé « gros » (taille de quelques millimètres). Les différentes piles d’images obtenues (après acquisitions selon différentes direction) sont alors fusionnées en une seule image 3D dont la qualité est alors meilleure.

Extensions[modifier | modifier le code]

Au cours des dernières années, plusieurs extensions ont été développées :

  • L’utilisation de deux feuilles de lumière qui se propagent en sens inverse permet de réduire certains artefacts typiques de la MFL, parmi lesquels l'apparition non désirée de zones d'ombres.[7]
  • En plus des feuilles de lumière qui se propagent en sens inverse, une configuration avec détection de deux côtés opposés a été proposée en 2012.[8] [9] Cette technique permet une reconstruction en 3D plus rapide.
  • Dans la microcopie de plan oblique[10] , l'objectif de détection est utilisé non seulement à des fins d'observation, mais également pour créer la feuille de lumière. Elle est émise sous un angle d'environ 60°. Puisqu'il est nécessaire que la feuille de lumière et le plan focal du détecteur optique coïncident pour qu'une image se forme, une optique supplémentaire est utilisée pour incliner du même angle le plan focal utilisé pour la détection.
  • La MFL a aussi été combinée avec l'excitation à deux photons, ce qui améliore la pénétration dans des échantillons épais.
  • La combinaison de la SPIM et de la spectroscopie de corrélation de fluorescence permet de mesures avec une bonne résolution spatiale de particules dans l'échantillon observé, en imagerie du vivant.[11] [12]
  • La MFL a été combinée avec la microscopie à super-résolution pour atteindre des résolutions dépassant la limite d'Abbe.[13] [14]

Le tableau ci-dessous énumère différentes versions de MFL.[15].

Nom Date Source de lumière Feuille de lumière Angle de détection Illumination Taille de l'échantillon Source
Ultramicroscopie 1903 Soleil Fente 90° Simple Perle d'or Siedentoph et Zsigmondy 1903
OPFOS 1993 laser 532 nm Lentille cylindrique 90° Simple >1cm Voie et al. 1993; Voie et Spelman 1995; Voie 2002
Microscopie theta confocale 1995 Laser 450-550 nm Trou d'épingle 102° Simple < 1 cm Stelzel et al. 1995
TSLM 2002 Laser 540 nm Lentille cylindrique 90° Simple > 1cm Fuchs et al. 2002
SPIM 2004 Laser 488 nm Lentille cylindrique 90° Simple < 1 cm Huisken et al. 2004
mSPIM 2007 Laser 488 nm Lentille cylindrique pivotante 90° Double <1cm Huisken et Stainier 2007
Ultramicroscopie 2007 Laser 488 nm Lentille cylindrique 90° Double >1cm Dodt et al. 2007
OPM 2008 Laser 532 nm Lentille cylindrique 60° Simple Simple Dunsby 2008
OCPI 2008 Laser 482 nm Lentille cylindrique ou à gradient d'indice 90° Simple <1cm Holekamp et al. 2008
TSLIM 2009 Laser 523-488 nm Lentille cylindrique 90° Double >1cm Santi et al. 2009

Préparation de l'échantillon[modifier | modifier le code]

Présentation de différentes préparations d'échantillon: embryon incorporé dans un gel gélifiant, plante grandissant dans un récipient fait d'un gel gélifié (méthode d'incorporation), cellules préparées par accrochage, liquide mis dans un sac à échantillon plat (méthode 4)

En MFL, l’échantillon n’est pas placé dans une lamelle, mais dans une chambre remplie d’un liquide. Des méthodes spécifiques de préparation ont alors été développées. Celles-ci doivent respecter certains critères. Elles doivent être mécaniquement stables : l’échantillon doit être bien maintenu de façon à éviter toute distorsion due à un mouvement lors de l’acquisition des images. La MFL étant utilisés en imagerie du vivant, ces méthodes ne doivent pas impacter les caractéristiques physiologiques des spécimens. Enfin, le but de la manipulation étant l’obtention d’images, ces méthodes ne doivent pas entraîner l’apparition d’artéfacts supplémentaires. On en distingue principalement quatre.

  • L’accrochage consiste à accrocher l’échantillon en utilisant une attache. Cette méthode est convient bien aux échantillons de grande taille (tels que les organes, les insectes). Toutefois, le contact entre l’échantillon et l’attache peut l’endommager le spécimen ou créer des artéfacts sur les images obtenues.
  • L’incorporation est la technique la plus utilisée. L’échantillon est plongé dans un agent gélifiant (en général du gel d’agarose) et est maintenu par un porte-spécimen. L’agent gélifiant est choisi de façon à présenter un indice de réfraction proche de celui de l’eau. Il est aussi primordial qu’il ne casse pas lors d’un déplacement de l’ensemble. Une limite à cette méthode réside dans l’effet de l’agent gélifiant sur l’échantillon. L’agent peut en effet entraver les mouvements de l’échantillon ou encore exercer des forces de compression sur ce dernier.
  • La troisième technique consiste à maintenir l’échantillon dans un récipient, lui-même maintenu par des attaches. Ces récipients sont généralement faits à partir d’agent gélifiant ou de polymères adaptés. Cette technique est adaptée pour imager des échantillons sensibles à la compression (par exemple des embryons en développement) ou encore pour les essais in vitro.(Engelbrecht et al., 2007; Keller et al., 2008) La principale limite de cette méthode réside en le récipient. Il doit être adapté au mieux à l’échantillon. Or, l’échantillon peut présenter des tailles très petites, et il est compliqué de préparer des chambres d’agarose présentant un diamètre de moins de 0.5 mm. Quant aux polymères, il n’est pas non plus aisé de trouver des polymères adaptés et qui présentent une forme s’adaptant bien aux petits échantillons.
  • La quatrième méthode consiste monter l’échantillon sur une surface plane.

Les mêmes précautions d’usage que pour les autres techniques de microscopie doivent être prises. La préparation de l’échantillon doit être faite de façon minutieuse, afin de ne pas le déformer. Ceci est d’autant plus important que pour la MFL, on procèdera à des translations et rotations de l’échantillon qui sera alors observé selon plusieurs directions.

Propriétés des images obtenues par MFL[modifier | modifier le code]

Artefacts[modifier | modifier le code]

Haut: Artefacts en MFL. Bas: Réduction d'artefacts par "pivotement"

Dans la mesure où la lumière entre dans l’échantillon par un côté, les obstacles se trouvant sur son chemin peuvent altérer la qualité de la feuille de lumière en absorbant ou en dispersant la lumière. Ceci cause des artéfacts sur les images obtenues, qui se caractérisent par des rayures brillantes ou sombres. Si certaines zones de l’échantillon présentent un indice de réfraction plus grand que le reste de l’échantillon, et ce de façon notable, des rayures brillantes peuvent apparaître à ces endroits. Une des solutions consiste à modifier rapidement l’orientation de la feuille de lumière d’une dizaine de degrés (méthode de "pivotement"). Ainsi, la lumière atteindra les zones se situant derrière les obstacles qu’elle a initialement rencontrés.[7] Enfin, la résolution des microscopes standards est déterminée par la longueur d’onde de la lumière utilisée et l’ouverture numérique de la lentille utilisée et est limitée par la nature ondulatoire de la lumière. Cela cause des artéfacts sur les images: des tâches peuvent apparaître.

Traitement d'images[modifier | modifier le code]

Les images obtenues sont en 2D. Déplacer l'échantillon à travers la feuille de lumière permet l'obtention d'images 3D ; les images 2D obtenues sont en effet empilées afin de reconstituer la structure de l'échantillon. La MFL nécessite alors souvent des techniques de traitement d'images, pour obtenir des images correctement exploitables, ou pour des fins de segmentation, afin de mettre en exergue des structures particulières dans l'échantillon observé. Les techniques de segmentation constituent un réel enjeu vis-à-vis de cette technique à ce titre, dans la mesure où un des buts recherché est l’obtention d’une segmentation automatique et rapide. Afin de corriger les artéfacts que peuvent présenter les images obtenues par MFL, des techniques de traitement d'images sont utilisées. La déconvolution d’image, qui prend en compte les propriétés des images permet de résoudre le problème de la limitation de la résolution des MFL, qui entraîne l'apparition de tâches. Du fait de leur bon rapport signal sur bruit et de leur bonne plage dynamique, les images obtenues par MFL sont très adaptées aux techniques de déconvolution. Verveer et al., 2007; Swoger et al., 2007). De plus, les MFL présentent souvent de faibles ouvertures numériques. La déconvolution peut alors améliorer de façon notable la qualité visuelle des images obtenue. Cette technique n’améliore toutefois pas la résolution. La résolution peut être améliorée en acquérant les images selon plusieurs directions. Du traitement d’images est alors utilisé pour fusionner les différentes piles d’images obtenues en une seule image 3D dont la qualité est alors meilleure.

Applications[modifier | modifier le code]

Cette technologie s'adresse à des échantillons de quelques dizaines de micromètres à quelques millimètres, en imagerie du vivant. La polyvalence de cet instrument ouvre de nombreuses perspectives d’applications et cette microscopie émergente fait aujourd'hui l'objet d'un intérêt majeur, car elle peut répondre à des questions jusque-là inexplorables du fait de l’absence de technologies adaptées. Des domaines aussi variés que la biologie cellulaire, la biologie du développement, la biologie marine, la biologie végétale et l’ingénierie tissulaire sont concernés.

References[modifier | modifier le code]

  1. ↑ U. Krzic, S. Günther, L. Hufnagel, D. von Gegerfelt, H. Karlsson, E. Illy, J. Hel: Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (SPIM) und Laser-Anregung in orange zur Abbildung lebender Organismen. In: BioPhotonik. Nr. 1, 2011, S. 42–44 (Online-Version).
  2. ↑ A. H. Voie, D. H. Burns, F. A. Spelman, « Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: Three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens », Journal of Microscopy, vol. 170, no 3,‎ , p. 229–236 (ISSN 0022-2720, DOI 10.1111/j.1365-2818.1993.tb03346.x, lire en ligne)
  3. ↑ J. Huisken, J. Swoger, F. Del Bene, J. Wittbrodt et E. H. Stelzer, « Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy », Science, vol. 305, no 5686,‎ , p. 1007–1009 (PMID 15310904, DOI 10.1126/science.1100035)
  4. ↑ K. Greger, J. Swoger, E. H. Stelzer: Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. In: The Review of scientific instruments. Band 78, Nr. 2, 2007, (ISSN 0034-6748), S. 023705, PMID 17578115.
  5. ↑ P. A. Santi, « Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review », Journal of Histochemistry & Cytochemistry, vol. 59, no 2,‎ , p. 129–138 (ISSN 0022-1554, DOI 10.1369/0022155410394857, lire en ligne)
  6. ↑ Yicong Wu, Peter Wawrzusin, Justin Senseney, Robert S Fischer, Ryan Christensen, Anthony Santella, Andrew G York, Peter W Winter, Clare M Waterman, Zhirong Bao, Daniel A Colón-Ramos, Matthew McAuliffe et Hari Shroff, « Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy », Nature Biotechnology, vol. 31, no 11,‎ , p. 1032–1038 (ISSN 1087-0156, DOI 10.1038/nbt.2713)
  7. ↑ a b et c Jan Huisken et Didier Y. R. Stainier, « Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM) », Optics Letters, vol. 32, no 17,‎ , p. 2608–10 (ISSN 0146-9592, PMID 17767321, DOI 10.1364/OL.32.002608, lire en ligne, consulté le )Inscription nécessaire
  8. ↑ Raju Tomer, Khaled Khairy, Fernando Amat et Philipp J Keller, « Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy », Nature Methods, vol. 9, no 7,‎ , p. 755–763 (ISSN 1548-7091, PMID 22660741, DOI 10.1038/nmeth.2062, lire en ligne, consulté le )Inscription nécessaire
  9. ↑ Uros Krzic, Stefan Gunther, Timothy E Saunders, Sebastian J Streichan et Lars Hufnagel, « Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging », Nature Methods, vol. 9, no 7,‎ , p. 730–733 (ISSN 1548-7091, PMID 22660739, DOI 10.1038/nmeth.2064, lire en ligne, consulté le )Inscription nécessaire
  10. ↑ C. Dunsby, « Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy », Optics Express, vol. 16, no 25,‎ , p. 20306 (ISSN 1094-4087, DOI 10.1364/OE.16.020306, lire en ligne, consulté le )
  11. ↑ Capoulade, J.; Wachsmuth, M.; Hufnagel, L.; Knop, M. =, « Quantitative fluorescence imaging of protein diffusion and interaction in living cells », Nature biotechnology, vol. 29, no 9,‎ , p. 835–839. (PMID 21822256, DOI 10.1038/nbt.1928, lire en ligne)
  12. ↑ T. Wohland, X. Shi, J. Sankaran, E. H. Stelzer =, « Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments », Optics express,‎ (ISSN 1094-4087, PMID 20588915, lire en ligne)
  13. ↑ Francesca Cella Zanacchi, Zeno Lavagnino, Michela Perrone Donnorso, Alessio Del Bue, Laura Furia, Mario Faretta, Alberto Diaspro, « Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples », Nature Methods, vol. 8, no 12,‎ , p. 1047–1049 (ISSN 1548-7091, PMID 21983925, DOI 10.1038/nmeth.1744, lire en ligne)
  14. ↑ Jerome Mertz; Jinhyun Kim, « Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection », Journal of Biomedical Optics, vol. 15, no 1,‎ (ISSN 1083-3668, PMID 20210471, DOI 10.1117/1.3324890, lire en ligne)
  15. ↑ P. A. Santi, « Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review », Journal of Histochemistry & Cytochemistry, vol. 59, no 2,‎ , p. 129–138 (ISSN 0022-1554, DOI 10.1369/0022155410394857, lire en ligne)

Pour aller plus loin[modifier | modifier le code]

  • Review of different LSFM modalities and results in developmental biology: J. Huisken et D.Y.R. Stainier, « Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology », Development, vol. 136, no 12,‎ , p. 1963–1975 (ISSN 0950-1991, PMID 19465594, PMCID 2685720, DOI 10.1242/dev.022426, lire en ligne, consulté le )
  • Review of LSFM for imaging anatomic structures: J. Buytaert, Emilie Descamps, Dominique Adriaens et Joris J. J. Dirckx, « The OPFOS Microscopy Family: High-Resolution Optical Sectioning of Biomedical Specimens », Anatomy Research International, vol. 2012,‎ , p. 206238–(1–9) (DOI 10.1155/2012/206238, lire en ligne)
  • Editorial: « Method of the Year 2014 », Nature Methods, vol. 12, no 1,‎ , p. 1 (DOI 10.1038/nmeth.3251, lire en ligne)Accès libre
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