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Introduction

Le travail expérimental de cette étude utilise le dosage de deux stéroïdes fécaux, la progestérone et l’œstradiol, comme méthode non-invasive permettant de suivre l’activité ovarienne chez les femelles primates non humaines qui sont l’objet de l’étude. Cette méthode a été préférée aux deux autres, urinaire et salivaire, en raison de sa mise en pratique plus facile sur des animaux qui n’ont pas suivi d’entraînement médical préalable afin d’uriner ou de mâcher un écouvillon sur demande. Une comparaison des dosages des stéroïdes fécaux et salivaires a été un temps envisagée afin d’établir une corrélation entre les résultats des deux méthodes. Ceci nous aurait permis de proposer une deuxième possibilité de prélèvement aux établissements zoologiques ne pouvant prélever de selles et ainsi d’accroître le nombre d’individus inclus dans l’étude. Cette comparaison a cependant été abandonnée après des résultats préliminaires non concluants obtenus à la station de primatologie de Rousset-sur-Arc et qui ne permettaient pas d’établir une corrélation (Lacoste, com. pers., 2016).

La possibilité d’utiliser en routine la méthode de dosage des stéroïdes fécaux pour la surveillance de la fonction de reproduction, et notamment d’évaluer la cyclicité, des femelles primates en parc zoologique, a été établie lors d’une étude précédente menée par Sandra Avril dans le cadre de sa thèse d’exercice vétérinaire (Avril, 2015). L’objectif de cette nouvelle étude est de poursuivre le suivi des cycles chez ces femelles, en incluant de nouveaux individus, ainsi que d’évaluer les effets de la pose d’un implant progestatif, technique utilisée actuellement avec une posologie empirique et une efficacité variable.

Le traitement des selles et les dosages hormonaux ont été réalisés au Laboratoire des dosages hormonaux vétérinaire (LDH Vet) d’Oniris (École Vétérinaire, Agroalimentaire et de l’Alimentation - Nantes Atlantique) sur des primates de quatre espèces (Capucin à poitrine jaune / Sapajus xanthosternos, Gibbon à favoris roux du Sud / Nomascus gabriellae, Gibbons à favoris blancs du Nord / Nomascus leucogenys et Gibbon à favoris blanc du Sud / Nomascus siki), hébergés au sein de parcs zoologiques français : Parc Zoologique et Botanique de Mulhouse, Jardin Zoologique de la Citadelle de Besançon et Zoo de la Palmyre.

Cette étude a été financée par le LDH Vet et ?

I- Matériel et Méthodes

Animaux L’étude menée concerne un nombre d’espèces restreint, au sein desquels les individus inclus ont été choisi selon des critères précis.

A- Espèces Les quatre espèces choisies font l’objet de programmes européens d’élevage pour les espèces menacées (EEP) coordonnés au Parc Zoologique et Botanique de Mulhouse par Brice Lefaux, pour les trois espèces de gibbons, et par Benoît Quintard, pour les capucins à poitrine jaune. Leur intérêt pour optimiser la reproduction et de ce fait de mieux gérer les populations captives européennes de ces espèces menacées dont ils ont la charge, est à l’origine de cette étude. Leurs fonctions de coordinateur permet d’avoir accès aux bases de données de ces populations (âge des individus, sexe, importance génétique, statut reproducteur, structures hébergeant l’espèce, etc.), ce qui a facilité le recrutement des animaux. L’intérêt de rassembler ces quatre espèces dans une même étude tient d’une part à l’utilisation d’une même technique de contraception réversible des femelles, dans un contexte similaire de limitation et d’espacement des naissances rendu nécessaire par un espace disponible fini. Elle trouve aussi son intérêt dans l’efficacité variable de cette technique, plutôt efficace chez les gibbons Nomascus, mais beaucoup plus aléatoire chez les capucins à poitrine jaune. Ces deux groupes d’espèces appartiennent à deux taxons  éloignés (catarhiniens et platyrhiniens) qui se distinguent notamment par des concentrations plasmatiques en hormones stéroïdiennes très différentes, ce qui laisse suspecter une différence physiologique qui pourrait apporter un élément d’explication à la différence d’efficacité constatée.

B- Individus Afin de suivre l’activité ovarienne et d’évaluer les effets de la pose de l’implant contraceptif, les parcs zoologiques participant aux EEP concernés ont été sollicités pour participer à l’étude. Les femelles éligibles au recrutement devaient être matures et cyclées, non gestantes, ne pas être déjà implantées, ne pas souffrir d’affection de l’appareil reproducteur ni d’affection de l’état général et ne pas être mises à la reproduction. L’implantation devait avoir une justification liée à la gestion de la population et ne devait pas être motivée uniquement par la réalisation de cette étude. En plus de ces critères restrictifs, les contraintes inhérentes au prélèvement de selles d’individus précis vivant généralement en groupe ont contribué à limiter fortement le nombre d’individus recrutés. En effet, certains parcs ont décliné lorsqu’ils étaient dans l’impossibilité d’isoler la femelle en question avant qu’elle ne défèque et donc d’identifier précisément la provenance des selles retrouvées, ou lorsqu’ils ne pouvaient pas ajouter une charge de travail à leurs soigneurs. Cinq femelles ont ainsi été recrutées. Elles sont âgées de 5 à 25 ans, sont a priori cyclées et n’ont pas d’antécédents médicaux concernant leur fonction reproductive.

Méthodes L’étude menée a nécessité la conception d’un protocole de prélèvement suivant un calendrier précis, la récolte des prélèvements par les institutions zoologiques participantes, leur envoi et leur traitement de préparation préalable au dosage. Les hormones ont ensuite été dosées et l’évolution des concentrations en fonction du temps ont été reconstituées.

C- Protocole et calendrier de prélèvement     Afin de suivre les cycles avant implantation à l’étonosgestrel, la collecte a commencé en amont de la pose de l’implant contraceptif et s’est poursuivie jusqu’à plusieurs mois après. Les cinq femelles de l’étude ont été implantées sous anesthésie générale à l’isoflurane avec un implant Nexplanon® (MSD), implant progestatif sous cutané placé en face palmaire du bras droit et contenant 68 mg d’étonogestrel. Les quatre femelles gibbons ont été implantées avec un implant entier alors qu’elles n’avaient reçu aucun procédé contraceptif au préalable. En revanche, la femelle capucin a été implantée avec un implant entier alors qu’elle était déjà sous contraceptif. En effet, suivant les recommandations antérieures, celle-ci avait été implanté avec un demi-implant Nexplanon® (34 mg) deux ans auparavant, ce qui avait conduit à un échec de contraception et à une naissance 7,5 mois plus tard. Lors de la pose de l’implant entier chez cette femelle, le reste du demi-implant a été retiré.

Le protocole de suivi de l’activité ovarienne des femelles proposé au parcs participants est le suivant : 2 fois par semaine pendant environ 7 semaines, afin de couvrir environ 2 cycles, 1 fois par jour, les trois jours précédant l’implantation, 1 fois le jour de l’implantation, 1 fois par jour, les trois jours suivant l’implantation, 1 fois par semaine pendant 4 semaines, 1 fois toutes les deux semaines pendant 8 semaines, 1 fois par mois pendant toute la durée de la contraception (dans l’idéal au moins 6 mois), 1 fois par semaine pendant les 4 semaines précédant la désimplantation, le cas échéant.

D- Récolte des prélèvements Le prélèvement des fèces a été réalisé par les soigneurs animaliers des zoos participants après observation directe de la défécation ou plus souvent après un isolement bref de l’individu dans une loge intérieure juste après un repas. La coloration des selles à l’aide de colorants alimentaires ajoutés à la ration était une technique d’identification proposée mais qui n’a pas été utilisée dans cette étude. Les selles ainsi récoltées ont été mises dans des pots à prélèvement neufs et non stériles, identifiés avec le nom de l’individu et la date du prélèvement. Elles ont ensuite été congelées à - 20 °C, avant d’être régulièrement expédiées par lots avec Chronopost, en maximum 24 h et sous couvert du froid à l’aide de pains de glace. Dès leur réception au LDHVet les colis ont été placés au congélateur à - 20 °C, en attente de traitement.

E- Dosage des stéroïdes fécaux Le traitement des prélèvements s’est fait selon la technique d’extraction et de dosage préalablement mise au point par Sandra Avril dans sa thèse d’exercice (Avril, 2015). Cette technique, adaptée du protocole de Céline Perrin et utilisé pour son travail de thèse vétérinaire portant sur le dosage des stéroïdes fécaux chez le guépard (Perrin, 2003), a été ainsi adaptée dans cette thèse d’exercice de 2015 afin d’en assurer la faisabilité pour les espèces concernées de primates non humains et la validation au LDHVet. La mise au point préalablement menée en 2015 a déterminé la nécessité de diluer les prélèvements au 40ème pour l’œstradiol et au 5ème pour la progestérone afin d’obtenir des valeurs de concentration comprises dans la gamme de dosage d’analyse. Le poids optimal de selles à prélever est de 200 g, le poids minimal à respecter étant de 50 g.

1- Traitements des prélèvements A l’exception de l’étape finale de dosage, toutes les étapes ont été réalisées par mes soins.

Lorsque cela était possible, du matériel consommable à usage unique a été utilisé (boîtes de Petri, tubes, bouchons, gants), dans le cas contraire le matériel a été nettoyé à l’eau, au savon et à l’éthanol à 70 ° (mortier et pilon en porcelaine, spatules en métal).

i- Dessiccation Afin d’être traités, les prélèvements sont décongelés sous une hotte puis étalés dans des boîtes de Petri. Lorsque le prélèvement est trop volumineux, il est homogénéisé avant d’en prélever le volume adéquat. Les boîtes de Petri sont ensuite placées dans un four dessiccateur ventilé à 70°C pendant au moins 24h (Memmert).

ii- Broyage Une fois déssiqué, chaque prélèvement est broyé à l’aide d’un mortier et d’un pilon en porcelaine jusqu’à obtention d’une poudre fine. Les éléments non fécaux (litière végétale, feuilles et pépins non digérés) sont retirés avant broyage.

iii- Pesée A partir de la poudre obtenue, une masse de 200 mg (± 10 mg) est prélevée et pesée dans un tube en verre sur une balance de précision (Sartorius, BP121S, d = 0,1 mg). La masse exacte de poudre est notée pour chaque prélèvement, information nécessaire aux calculs ultérieurs de la masse de stéroïdes présente dans chaque gramme de selles.

iv- Extraction Les selles déssiquées et réduites en poudre ne permettent pas le dosage direct des stéroïdes, une étape d’extraction est nécessaire afin d’isoler les stéroïdes de la matrice fécale. Pour ce faire, du méthanol pur à 99,9 %, un solvant organique fortement polaire, est ajouté dans les tubes à essai contenant la poudre de selles. Ces tubes sont agités sur un vortex pendant 1 minute afin de maximiser le contact entre la poudre et le méthanol. Ils sont ensuite centrifugés quelques minutes à 3000 tours/minute. Le surnageant est prélevé à la micropipette et placé dans un tube à essai identifié en correspondance. La poudre de selles subit cette étape 3 fois consécutivement avec 1 mL, 0,5 L et 0,5 mL de méthanol pour obtenir à la fin environ 2 mL de surnageant. Le surnageant est par la suite évaporé sous azote jusqu’à obtention d’un extrait sec tapissant le fond du tube à essai. Cet extrait est conservé à +4°C jusqu’à l’étape suivante.

v- Dilution     En prévision des dosages, l’extrait sec est solubilisé dans 1 mL de méthanol sous agitation sur un vortex. Les dilutions sont ensuite réalisées avec des solutions tampon adaptées à chaque dosage. Ces solutions tampon se rapprochent de la polarité, du pH et de la concentration en électrolytes du sérum sanguin car les techniques de dosage des hormones sexuelles utilisées sont conçues pour des prélèvements sanguins. La quantité de tampon ajoutée à la solution est définie par la dilution mise au point dans l’étude de Sandra Avril afin que les valeurs mesurées soient comprises dans la gamme d’analyse des techniques utilisées. Ainsi, pour le dosage de la progestérone par radio-immunologie (RIA) on prélève 20 µL de solution auxquels on ajoute 80 µL de solution tampon Tris-BSA-Triton : mélange d’une solution d’HCl (Trizma®-HCl, Sigma®), d’une solution de t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100, Sigma®) et de BSA (Albumin Bovine Serum, Sigma®). On obtient ainsi une dilution au 5ème. De même, pour le dosage de l’œstradiol par immuno-enzymologie (ELISA) on prélève 10 µL de solution auxquels on ajoute 390 µL de solution tampon SFS (Steroid Free Serum, Demeditec®). On obtient ainsi une dilution au 40ème.

2- Dosages des hormones L’étude de Sandra Avril ayant mis en avant que la concentration fécale de l’œstrone suivait l’évolution de la concentration fécale de la progestérone au cours du temps, le dosage de l’œstrone n’a donc pas été réalisé dans cette étude, n’apportant pas d’information supplémentaire.

La progestérone a été dosée par radio-immunologie (RIA) avec les kits Beckman-Coulter® IM1188 à partir d’une prise d’essai de 50 μL. L’œstradiol a été dosé par immuno-enzymologie (ELISA) avec les kits Demeditec® DE4399 à partir d’une prise d’essai de 75 μL.