Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

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Diagramme du mécanisme de CRISPR.

En génétique, les Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (« Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées »), plus fréquemment désignées sous le nom de CRISPR (acronyme prononcé /ˈkrɪspəʳ/), sont des familles de séquences répétées dans l'ADN. Une telle famille se caractérise par des séries de répétitions directes courtes (de 21 à 37 paires de bases) et régulièrement espacées par des séquences appelées « spacer », généralement uniques, de 20 à 40 paires de bases.

Le système CRISPR-Cas9, d'abord utilisé pour typer des souche de bactéries est récemment devenu un outil de génie génétique à fort potentiel[1].

Première observation et redécouvertes successives[modifier | modifier le code]

Cette structure répétée a été observée pour la première fois par Yoshizumi Ishino[2] en 1987 chez Escherichia coli. Elle a ensuite été décrite plusieurs fois sous différents noms :

  • LCTR pour Long Clusters of Tandem Repeats. Deux de ces régions sont associées à des LCTR (typique des Archaea) ce qui supporte l’idée que ces LCTR soient impliqués dans le transfert de gènes[3] ;
  • SPIDR pour Spacer Interspaced Direct Repeats[4] ;
  • TREP pour Tandem REPeats[5] ;
  • DVR pour Direct Variable Repeats[6] ;
  • SRSR pour Short Regularly Spaced Repeats[7].

À la suite de l'article de Mojiica de 2000[7] démontrant que toutes les descriptions précédentes n'étaient que des facettes d'une seule et même entité, Jansen décide en 2002, avec l'accord du groupe de Mojica de clarifier la nomenclature en créant l'acronyme CRISPR[8]. Si la séquence répétée est bien conservée au sein d'un organisme, le nombre d'unités au sein d'un train, le nombre de trains et même la présence de trains sont des quantités hautement variables d'une lignée à une autre[9]. De fait, les CRISPR ont été utilisés pour typer des souches bactériennes, une technique appelée spoligotypage[10],[11].

Répartition dans le monde vivant[modifier | modifier le code]

Ces répétitions se rencontrent dans les lignées d'archébactéries et de bactéries, mais n'ont pas encore été observées chez les eucaryotes. Chez les virus, il a été montré que des phages codent pour le système CRISPR-Cas[12]. Les CRISPR pourraient être la famille de répétition la plus largement répandue dans le monde vivant[7], avec un peu moins de la moitié des organismes séquencés porteurs de ce type de répétitions (sur plus de 200 génomes testés en fin 2005[13]). Les régions CRISPR occupent la quasitotalité du génome archéen (soit plus de 99 % du génome chez les archées analysées) et près de la moitié du génome bactérien[14], concernant aussi bien les bactéries à Gram+ que les bactéries à Gram-)[15] Certains plasmides d'archées sont porteurs de CRISPR homologues de ceux portés par l'organisme hôte. C'est le cas par exemple de Sulfolobus et du plasmide pNOB8[16],[17]. Certains auteurs ont signalé la présence de CRISPR dans l'ADN mitochondrial (Flamand, 1992[réf. à confirmer]), mais ces résultats n'ont pas pu être reproduits.

Structure[modifier | modifier le code]

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Les locus CRISPR sont caractérisés par une alternance de répétitions directes ou « direct repeats » (c'est-à-dire toutes orientées dans le même sens de lecture), courtes (de 21 à 37 paires de bases) et régulièrement espacées par des séquences appelées « spacers », généralement uniques, de 20 à 40 paires de bases. Les séquences nucléotidiques et la longueur des locus CRISPR sont conservées pour une même espèce, mais varient d'une espèce à l'autre[4],[18]. Les locus CRISPR sont généralement adjacents aux gènes cas (pour « CRISPR associated »)[18], dont ils sont séparés par une séquence de 300 à 500 paires de bases, appelée séquence « leader »[8].

Les premiers éléments sur la façon dont la structure CRISPR elle-même (i.e. la portion constituée de la succession de direct repeats et de spacers évolue ont été fournis par le travail de Pourcel et al.[19]. Ce travail, portant sur les locus CRISPR de Yersinia pestis, a montré que l'acquisition de nouveaux spacers était polarisée, alors que la perte d'un ou plusieurs « spacers » pouvait survenir tout au long du locus CRISPR. L'acquisition survient de façon adjacente au leader. Le leader est conservé dans la lignée mais pas entre les lignées[4].

Gènes cas[modifier | modifier le code]

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Rencontrés uniquement dans les génomes porteurs de CRISPR, les gènes cas sont généralement situés à proximité des locus CRISPR. À ce jour[Quand ?], plus de 45 familles de gènes de ce type ont été décrites. Les 4 premières étant strictement associées[13]. Le plus important de ces gènes est cas1, présent dans presque tous les complexes CRISPR-Cas (parfois notés CRISPR/Cas). La distribution sporadique des sous-types CRISPR-Cas suggère plusieurs évènements de transferts horizontaux au cours de l'évolution microbienne. Les systèmes CRISPR-Cas peuvent être très étendus (jusqu'à 20 gènes différents) et semblent présenter des schémas différents d'une lignée à l'autre, qui ne se retrouvent que dans un nombre très limité d'espèces. Les gènes cas repérés chez des organismes hyperthermophiles ont d'abord été vus comme jouant un rôle de réparation de l'ADN[17].

Rôles[modifier | modifier le code]

Si la ou les fonctions des CRISPR n'ont pas encore été clairement identifiées, un certain nombre d'hypothèses ont été avancées.

  • Les CRISPR sont impliqués dans la répartition des copies de génomes au cours de la division (expériences menées sur Haloferax mediterranei[5]). Des similitudes avec certains mécanismes de partition de plasmides suggèrent que les CRISPR sont des analogues des séquences de partitionnement bactériennes. Sans être vital pour la cellule puisque certaines lignées en sont dépourvues[7].
  • Les CRISPR ont un rôle de perturbateur chromosomique en permettant des recombinaisons et sont impliqués dans le système de restauration chromosomique à la suite d'un réarrangement[7] : il a été montré qu'il y a une relation forte entre les CRISPR et les réarrangements[20]. Le motif répété faciliterait les recombinaisons.
  • Deux de ces régions sont associées à des LCTR (typiques des Archaea) ce qui supporte l’idée que ces LCTR sont impliqués dans le transfert de gènes[3]. Nelson a proposé que les CRISPR sont associés à l'origine de réplication et jouent un rôle dans le processus de réplication du chromosome (il a placé le nucléotide 1 comme étant le premier d'un CRISPR).
  • Chez les archées, site de fixation pour la formation de nucléosomes (enroulement de l’ADN autour de protéines similaires à des histones) permettant de protéger l’ADN ou de réguler l’expression génique[21].
  • Ces séquences forment des structures secondaires (épingles, Z-DNA et H-DNA) ayant des fonctions de régulation ou de protection[21].

Rôle « immunitaire » du système CRISPR-Cas[modifier | modifier le code]

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En 2005, on observe que les sequences de certains spacers sont identiques à celles de certains éléments génétiques mobiles, notamment de virus et de plasmides[22],[19],[23].

En mars 2007, l'équipe de Philippe Horvath a montré que l'exposition de cellules porteuses de CRISPR à des phages entraîne l'apparition de nouveaux intervalles, que ces intervalles dérivent du matériel génomique des phages et que le retrait ou l'ajout de ces intervalles modifie la résistance des bactéries face aux phages[24].

Le système CRISPR-Cas (CASS) est un mécanisme de défense contre les phages et plasmides invasifs, fonctionnant d'une manière analogue à celle du système ARNi des eucaryotes. En intégrant des fragments de gènes étrangers au sein de chromosomes archéens ou bactériens, il confère une résistance aux phages et plasmides.
Il s'agit donc d'une forme de système immunitaire héritable par transmission aux cellules filles, permettant aux archées et aux bactéries de faire face au changement rapide des phages et des plasmides[8],[22],[19],[25].Il a été montré que les phages pouvaient contourner le système CRISPR-Cas via des gènes spécifiques[26].

Les systèmes CRISPR-Cas observés chez les bactéries et les archées d'une part et le système ARNi observé chez les eucaryotes d'autre part ne semblent pas dériver d'un ancêtre commun. Ils ne sont donc pas homologues.

Mécanismes moléculaires[modifier | modifier le code]

Les systèmes CRISPR utilisent les gènes cas1 et cas2 qui sont impliqués dans l'intégration, en tant que spacer de fragments de gènes étrangers dans le CRISPR.

Trois types de systèmes CRISPR-Cas sont connus[27] :

  • Les systèmes de types I, utilisent un complexe Cascade pour cliver les transcrits de CRISPR au niveau des épingles. Lorsqu'un complexe Cascade/spacer s'associe à un ADN cible (reconnaissance par hybridations) il recrute la protéine Cas3 qui clive un brin e l'ADN cible).
  • Les systèmes de types II, utilisent la RNAse III pour séparer les répétitions des transcrits. La protéine Cas9 s'associent avec un fragment de transcrit et, lors de la reconnaissance d'un ADN cible, Cas9 clive les 2 brins de cet ADN.
  • Les systèmes de type III, utilisent la protéine Cas6 pour cliver les transcrits de CRISPR au niveau des épingles, les segments de transcrits obtenus s'associent avec un complexe Cas10. Ce système requiert qu'il y ait transcription de l'ADN cible, le complexe Cas10/spacer clive alors un brin de l'ADN cible (brin non transcrit), ainsi que l'ARN en cours de transcription.

Utilisation en biologie moléculaire[modifier | modifier le code]

Le système CRISPR-Cas9, notamment tel que développé par la chercheuse française Emmanuelle Charpentier sur la base d'une idée qu'elle a eue à Vienne au début des années 2000 (qui l'a fait pressentir pour le prix Nobel 2015[1]) est depuis les années 2010 devenu un outil de génie génétique révolutionnaire permettant de modifier plus facilement et plus précisément les séquences d’ADN. Il pourrait à terme contribuer à éliminer certaines maladies, mais suscite des questions d'éthique médicale et environnementale quant à l'eugénisme et aux conséquences environnementales de la manipulation du génome, quand cet outil est appliqué à des cellules héréditaires[28],[29].

CRISPR Therapeutics, startup cofondée par Emmanuelle Charpentier pour breveter et développer cet outil est devenue l'une des sociétés de biotechnologies précliniques les plus richement financés dans le monde, mais est en conflit concernant le brevetage de cette technologie[30],[1]. E. Charpentier a en avril 2016 présenté dans le journal Nature une nouvelle version, encore plus performante d'utilisation du CRISPR[1].

Annexes[modifier | modifier le code]

Articles connexes[modifier | modifier le code]

Liens externes[modifier | modifier le code]

Références[modifier | modifier le code]

  1. a, b, c et d Abbott A (2016) The quiet revolutionary: How the co-discovery of CRISPR explosively changed Emmanuelle Charpentier’s life The microbiologist spent years moving labs and relishing solitude. Then her work on gene-editing thrust her into the scientific spotlight ; Nature 532, 432–434 (28 April 2016) doi:10.1038/532432a
  2. (en) Yoshizumi Ishino, Hideo Shinagawa, Kozo Makino, Mitsuko Amemura et Atsuo Nakata, « Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product », Journal of Bacteriology, vol. 169, no 12,‎ , p. 5429–5433 (PMID 3316184)
  3. a et b (en) Nelson KE, « Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. », Nature, vol. 399, no 6734,‎ , p. 323-9 (PMID 10360571)
  4. a, b et c (en) Ruud Jansen, Jan D. A. van Embden, Wim Gaastra et Leo M. Schouls, « Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes », OMICS, vol. 6, no 1,‎ , p. 23-33 (PMID 11883425)
  5. a et b (en) Mojica Francisco, « Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. », Molecular Microbiology, vol. 17, no 1,‎ , p. 85-93 (PMID 7476211)
  6. (en) Aranaz A., « Spoligotyping profile change caused by deletion of a direct variable repeat in a Mycobacterium tuberculosis isogenic laboratory strain. », Journal of Clinical Mirobiology, vol. 42, no 11,‎ , p. 5388-91 (PMID 15528751)
  7. a, b, c, d et e (en) Francisco Mojica, Cesar Diez-Villaseñor, Elena Soria et Guadalupe Juez, « Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria », Molecular Microbiology, vol. 36, no 1,‎ , p. 244–246 (PMID 10760181)
  8. a, b et c (en) Ruud Jansen, Jan D. A. van Embden, Wim Gaastra et Leo M. Schouls, « Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes », Molecular Microbiology, vol. 43, no 6,‎ , p. 1565–1575 (PMID 11952905, lire en ligne)
  9. (en) van Embden JD, « Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. », Journal of Bacteriology, vol. 182, no 9,‎ , p. 2393-401 (PMID 10762237)
  10. (en) Kamerbeek J, « Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. », Journal of Clinical Microbiology, vol. 35, no 4,‎ , p. 907-14 (PMID 9157152)
  11. (en) Hoe, « Rapid molecular genetic subtyping of serotype M1 group A Streptococcus strains. », Emerging Infectious Diseases, vol. 5, no 2,‎ , p. 254-63 (PMID 10221878)
  12. (en) Kimberley D. Seed, David W. Lazinski, Stephen B. Calderwood et Andrew Camilli, « A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity », Nature, vol. 494, no 7438,‎ , p. 489-91 (PMID 23446421, PMCID 3587790, DOI 10.1038/nature11927, lire en ligne)
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  14. (en) Makarova KS, Wolf YI et Koonin EV, « Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. », Nucleic Acids Research, vol. 41, no 8,‎ , p. 4360-4377 (PMID 23470997, PMCID PMC3632139, DOI 10.1093/nar/gkt157, lire en ligne)
  15. (en) Reidun K. Lillestøl, Peter Redder, Roger A. Garrett et Kim Brüger, « A putative viral defense mechanism in archaeal cells », Archaea, vol. 2, no 1,‎ , p. 59-72 (PMID 16877322, PMCID PMC2685585, lire en ligne)
  16. (en) Xu Peng, Kim Brügger, Biao Shen, Lanming Chen, Qunxin She et Roger A. Garrett, « Genus-Specific Protein Binding to the Large Clusters of DNA Repeats (Short regularly Spaced Repeats) Present in Sulfolobus Genomes », Journal of Bacteriology, vol. 185, no 8,‎ , p. 2410-7 (PMID 12670964, PMCID PMC152625, lire en ligne)
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  28. Jean-Philippe Braly, « CRISPR-Cas9 : le couteau suisse qui révolutionne la génétique », sur Sciences actualités,‎ (consulté le 26 août 2015)
  29. Morgane Heuclin-Reffait, « Avec «Crispr/Cas9», modifier un ADN devient presque aussi simple qu'un copier-coller », sur Libération Sciences,‎ (consulté le 26 août 2015)
  30. Ledford, Heidi (2016) How the US CRISPR patent probe will play out ; Decision could determine who profits from the gene-editing technique in future. 07 mars 2016
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