Phage display

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Les différentes étapes de la réalisation d'un phage display.

Le Phage display est une technique de laboratoire permettant d'étudier les interactions entre protéines, peptides et ADN en utilisant des bactériophages pour relier les protéines aux gènes qui codent pour elles[1]. Le phage display a d'abord été décrit par George P. Smith en 1985, quand il a fait la démonstration de l'affichage de peptides à la surface d'un phage filamenteux grâce à la fusion du peptide d'intérêt avec le gène III du phage[1]. Un brevet appartenant à George Pieczenik antérieur à 1985 décrit également la génération de bibliothèques de phage display[2]. Cette technologie a par la suite été perfectionnée par des équipes du MRC Laboratory of Molecular Biology de Cambridge, comprenant Winter et McCafferty, ainsi que par le Scripps Research Institute, rendant possible l'affichage de protéines telles que des anticorps à usage thérapeutique. En faisant la connexion entre le génotype et le phénotype, cette technique permet de screener et amplifier de vastes bibliothèques de fragments de protéines dans un processus appelé « sélection in vitro », qui est analogue à la sélection naturelle. Les bactériophages les plus souvent utilisés pour le phage display sont le bactériophage M13 et le phage filamenteux fd[3],[4] bien que les phages T4[5], T7 et λ aient aussi été utilisés.

Principe[modifier | modifier le code]

Comme pour la technique du double hybride, le phage display est utilisé pour le criblage haut débit d’interactions protéiques. Dans le cas du bactériophage M13, l'ADN codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt est lié au gène pIII ou pVIII, qui codent respectivement pour les protéines de capside mineure et majeure. Des sites multiples de clonage sont parfois utilisés afin de s'assurer que les fragments seront insérés dans chacun des trois cadres de lecture possibles, de sorte que le gène soit au moins une fois transcrit correctement. L'hybride d'ADN constitué par le gène du phage et le gène d'intérêt est inséré dans Escherichia coli, de façon à ce que le phage modifié soit produit par la bactérie.

On immobilise en parallèle la seconde protéine ou ADN d'intérêt à la surface d'un puits de plaque microtitre, que l'on met en contact avec le phage modifié. S'il y a une interaction entre la protéine exprimée à la surface du phage et cette cible, le phage restera accroché au puits alors que les autres phages seront éliminés par le lavage. On procède ensuite à l'élution des phages fixés, que l'on récupère pour infecter d'autres bactéries et augmenter leur quantité. La répétition de cette méthode est appelée biopanning, en référence aux techniques employées pour l'enrichissement d'un échantillon d'or. À la fin, on procède au séquençage de l'ADN des phages produits par les bactéries, ce qui permet de caractériser les protéines interagissant.

Si l'on utilise comme vecteur un phagemide, les E. coli ne peuvent produire des virions que quand elles ont été infectées par un autre virus appelé virus assistant. On peut éliminer le besoin d'un virus assistant un utilisant la technologie des bacterial packing cell lines[6].

Applications[modifier | modifier le code]

La technologie du phage display permet de découvrir les partenaires d'interaction d'une protéine. Pour cela, on fixe la protéine aux puits et on l'expose à un ensemble de phages modifiés exprimant à leur surface toutes les séquences codantes d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme[7]. Le phage display est aussi largement utilisé pour simuler in vitro l'évolution d'une protéine (en ingénierie des protéines). Cela fait du phage display un outil intéressant de conception de médicament. On peut l'utiliser pour trouver de nouveaux ligands (inhibiteurs d'enzyme, agonistes ou antagonistes d'un récepteur)[8],[9],[10].

On utilise aussi cette technique pour déterminer les antigènes d'une tumeur, ce qui a des applications en diagnostic et en thérapeutique[11], ainsi que pour créer des interactions ADN-protéine à l'aide de bibliothèques d'ADN générés aléatoirement pour l'occasion[12].

L'invention de l'expression par phage display d'anticorps a révolutionné la recherche thérapeutique sur ces derniers[13],[14]. En 1991, le groupe Scripps a pour la première fois réalisé l'affichage et la sélection d'un anticorps humain à la surface d'un phage[15]. Cette étude initiale avait permis l'isolement d'un fragment Fab se fixant à la tétanospasmine, et le clonage rapide d'anticorps humains anti-HIV à des fins thérapeutiques[16],[17],[18],[19],[20]. Par la suite, cela a permis la création des premiers anticorps humains de synthèse, par assemblage de différents fragments[21],[22],[23],[24].

L'industrie pharmaceutique utilise couramment des bibliothèques contenant des millions d'anticorps exprimés sur des phages pour isoler des anticorps thérapeutiques fortement spécifiques, en particulier dans le domaine des anticancéreux et des immunosuppresseurs. L'un des plus grands succès a été la mise sur le marché d'HUMIRA (adalimumab) par la Cambridge Antibody Technology et les laboratoires Abbott. Cet anticorps se fixe au TNF-alpha et a été le tout premier anticorps entièrement humain commercialisé[25], atteignant un chiffre d'affaires annuel dépassant le milliard de dollar[26].

Parmi les autres méthodes utilisables dans le même objectif, on trouve le yeast display, le bacterial display, le ribosome display et le mRNA display.

Outils informatiques[modifier | modifier le code]

Les bases de données de mimotopes (c'est-à-dire de peptides mimant la structure d'un épitope, et propres à déclencher la même réaction immunitaire) ont joué un rôle important dans l'étude du phage display[27].

Des bases de données[28], des programmes et des serveurs web sont utilisés pour exclure des peptides sans relation avec la cible de l'étude, caractériser des relations entre les protéines et des petites molécules, et pour cartographier les interactions protéines-protéines[29].

Voir aussi[modifier | modifier le code]

Références[modifier | modifier le code]

  1. a et b Smith GP, « Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface », Science, vol. 228, no 4705,‎ juin 1985, p. 1315–7 (PMID 4001944, DOI 10.1126/science.4001944, Bibcode 1985Sci...228.1315S)
  2. « Method and means for sorting and identifying biological information »
  3. Smith GP, Petrenko VA, « Phage Display », Chem. Rev., vol. 97, no 2,‎ avril 1997, p. 391–410 (PMID 11848876, DOI 10.1021/cr960065d)
  4. Kehoe JW, Kay BK, « Filamentous phage display in the new millennium », Chem. Rev., vol. 105, no 11,‎ novembre 2005, p. 4056–72 (PMID 16277371, DOI 10.1021/cr000261r)
  5. Malys N, Chang DY, Baumann RG, Xie D, Black LW, « A bipartite bacteriophage T4 SOC and HOC randomized peptide display library: detection and analysis of phage T4 terminase (gp17) and late sigma factor (gp55) interaction », J Mol Biol, vol. 319, no 2,‎ 2002, p. 289–304 (PMID 12051907, DOI 10.1016/S0022-2836(02)00298-X)
  6. Chasteen L, Ayriss J, Pavlik P, Bradbury AR, « Eliminating helper phage from phage display », Nucleic Acids Res., vol. 34, no 21,‎ 2006, e145 (PMID 17088290, PMCID 1693883, DOI 10.1093/nar/gkl772)
  7. Explanation of "Protein interaction mapping" from The Wellcome Trust
  8. Lunder M, Bratkovic T, Doljak B, Kreft S, Urleb U, Strukelj B, Plazar N, « Comparison of bacterial and phage display peptide libraries in search of target-binding motif », Appl. Biochem. Biotechnol., vol. 127, no 2,‎ novembre 2005, p. 125–31 (PMID 16258189, DOI 10.1385/ABAB:127:2:125)
  9. Bratkovic T, Lunder M, Popovic T, Kreft S, Turk B, Strukelj B, Urleb U, « Affinity selection to papain yields potent peptide inhibitors of cathepsins L, B, H, and K », Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 332, no 3,‎ juillet 2005, p. 897–903 (PMID 15913550, DOI 10.1016/j.bbrc.2005.05.028)
  10. Lunder M, Bratkovic T, Kreft S, Strukelj B, « Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display using different elution strategies », J. Lipid Res., vol. 46, no 7,‎ juillet 2005, p. 1512–6 (PMID 15863836, DOI 10.1194/jlr.M500048-JLR200)
  11. Hufton SE, Moerkerk PT, Meulemans EV, de Bruïne A, Arends JW, Hoogenboom HR, « Phage display of cDNA repertoires: the pVI display system and its applications for the selection of immunogenic ligands », J. Immunol. Methods, vol. 231, no 1–2,‎ décembre 1999, p. 39–51 (PMID 10648926, DOI 10.1016/S0022-1759(99)00139-8)
  12. Gommans WM, Haisma HJ, Rots MG, « Engineering zinc finger protein transcription factors: the therapeutic relevance of switching endogenous gene expression on or off at command », J. Mol. Biol., vol. 354, no 3,‎ décembre 2005, p. 507–19 (PMID 16253273, DOI 10.1016/j.jmb.2005.06.082)
  13. McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, Chiswell DJ, « Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains », Nature, vol. 348, no 6301,‎ décembre 1990, p. 552–4 (PMID 2247164, DOI 10.1038/348552a0, Bibcode 1990Natur.348..552M)
  14. (en) Scott JS, Barbas CF III, Burton, DA, Phage Display: A Laboratory Manual, Plainview, N.Y, Cold Spring Harbor Laboratory Press,‎ 2001 (ISBN 0-87969-740-7)
  15. Barbas CF, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ, « Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site », Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 88, no 18,‎ septembre 1991, p. 7978–82 (PMID 1896445, PMCID 52428, DOI 10.1073/pnas.88.18.7978, Bibcode 1991PNAS...88.7978B)
  16. Burton DR, Barbas CF, Persson MA, Koenig S, Chanock RM, Lerner RA, « A large array of human monoclonal antibodies to type 1 human immunodeficiency virus from combinatorial libraries of asymptomatic seropositive individuals », Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 88, no 22,‎ novembre 1991, p. 10134–7 (PMID 1719545, PMCID 52882, DOI 10.1073/pnas.88.22.10134, Bibcode 1991PNAS...8810134B)
  17. Barbas CF, Björling E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa D, Jones TM, Zebedee SL, Persson MA, Nara PL, Norrby E, « Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro », Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 89, no 19,‎ octobre 1992, p. 9339–43 (PMID 1384050, PMCID 50122, DOI 10.1073/pnas.89.19.9339, Bibcode 1992PNAS...89.9339B)
  18. Burton DR, Pyati J, Koduri R, Sharp SJ, Thornton GB, Parren PW, Sawyer LS, Hendry RM, Dunlop N, Nara PL, « Efficient neutralization of primary isolates of HIV-1 by a recombinant human monoclonal antibody », Science, vol. 266, no 5187,‎ novembre 1994, p. 1024–7 (PMID 7973652, DOI 10.1126/science.7973652, Bibcode 1994Sci...266.1024B)
  19. Yang WP, Green K, Pinz-Sweeney S, Briones AT, Burton DR, Barbas CF, « CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range », J. Mol. Biol., vol. 254, no 3,‎ décembre 1995, p. 392–403 (PMID 7490758, DOI 10.1006/jmbi.1995.0626)
  20. Barbas CF, Hu D, Dunlop N, Sawyer L, Cababa D, Hendry RM, Nara PL, Burton DR, « In vitro evolution of a neutralizing human antibody to human immunodeficiency virus type 1 to enhance affinity and broaden strain cross-reactivity », Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 91, no 9,‎ avril 1994, p. 3809–13 (PMID 8170992, PMCID 43671, DOI 10.1073/pnas.91.9.3809, Bibcode 1994PNAS...91.3809B)
  21. Barbas CF, Bain JD, Hoekstra DM, Lerner RA, « Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem », Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 89, no 10,‎ mai 1992, p. 4457–61 (PMID 1584777, PMCID 49101, DOI 10.1073/pnas.89.10.4457, Bibcode 1992PNAS...89.4457B)
  22. Barbas CF, Languino LR, Smith JW, « High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site », Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 90, no 21,‎ novembre 1993, p. 10003–7 (PMID 7694276, PMCID 47701, DOI 10.1073/pnas.90.21.10003, Bibcode 1993PNAS...9010003B)
  23. Barbas CF, Wagner J, « Synthetic Human Antibodies: Selecting and Evolving Functional Proteins », Methods, vol. 8, no 2,‎ octobre 1995, p. 94–103 (DOI 10.1006/meth.1995.9997)
  24. Barbas CF, « Synthetic human antibodies », Nat. Med., vol. 1, no 8,‎ août 1995, p. 837–9 (PMID 7585190, DOI 10.1038/nm0895-837)
  25. Lawrence S, « Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters », Nat. Biotechnol., vol. 25, no 4,‎ avril 2007, p. 380–2 (PMID 17420735, DOI 10.1038/nbt0407-380)
  26. « Cambridge Antibody: Sales update » (ArchiveWikiwixArchive.isGoogleQue faire ?). Consulté le 2013-11-04
  27. Huang J, Ru B, Dai P, « Bioinformatics resources and tools for phage display », Molecules, vol. 16, no 1,‎ 2011, p. 694–709 (PMID 21245805, DOI 10.3390/molecules16010694)
  28. Huang J, Ru B, Zhu P, Nie F, Yang J, Wang X, Dai P, Lin H, Guo FB, Rao N, « MimoDB 2.0: a mimotope database and beyond », Nucleic Acids Res., vol. 40, no Database issue,‎ janvier 2012, D271–7 (PMID 22053087, PMCID 3245166, DOI 10.1093/nar/gkr922)
  29. Huang J, Ru B, Li S, Lin H, Guo FB, « SAROTUP: scanner and reporter of target-unrelated peptides », J. Biomed. Biotechnol., vol. 2010,‎ 2010, p. 101932 (PMID 20339521, PMCID 2842971, DOI 10.1155/2010/101932)

Autre lectures[modifier | modifier le code]